Білки-транспортери кремнію: довгий шлях до відкриття

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 68

Для опису способу, яким діатомові водорості будують свої «скляні» будиночки з кремнезему, вкриті вишуканими орнаментами мікро- і нанометрового масштабу, сьогодні використовують термін «кремнієві нанотехнології». Один з головних етапів цієї технології — транспортування кремнієвої кислоти з навколишнього середовища, де її концентрації досить низькі, особливо в прісній воді. Здійснюють цю роботу унікальні білки, здатні зв’язуватися з кремнієвою кислотою без її полімеризації, причому через їх «невловимість» всі висновки про структуру і роботу активного центру цих білків доводиться робити виключно на основі аналізу даних «розшифровки» відповідних генів і генних фрагментів.

Про авторів

Дарина Петрова — кандидат біологічних наук, науковий співробітник відділу ультраструктури клітини Лімнологічного інституту СО РАН (Іркутськ). Автор і співавтор 18 наукових робіт.

Артем Михайлович Марченков — аспірант і провідний інженер відділу ультраструктури клітини Лімнологічного інституту СО РАН (Іркутськ). Автор і співавтор 2 наукових робіт.

Єдиний спосіб визначити межі можливого — вийти за ці кордони.

Артур Кларк

Вражаючої краси і міцності панцирі діатомових водоростей — вражаючий приклад мікро- і наноструктурованого природного матеріалу. Незважаючи на те що ці дивовижні мікроводорості відомі ще з XVIII ст., сучасні молекулярні біологи поки не володіють повними даними про те, як діатомеї перетворюють інформацію, закодовану в геномах, в ці складні кремнисті конструкції.

У тому числі недостатньо вивчені і такі базові етапи процесу формування елементів панцира водоростей, як захоплення кремнієвої кислоти з навколишнього середовища і перенесення її в спеціальні органели, де відбувається полімеризація кремнію. Говорячи про кремнію, ми маємо на увазі, що насправді створка діатомей побудована не з кремнію, а з кремнезему (SiO₂· H2_O), а в клітку надходить не чистий кремній, а вільна кремнієва кислота (Si (OH) 4).

І тут діатомові водорості стикаються з двома проблемами: по-перше, вони повинні забирати кремнієву кислоту з середовища проти дуже «крутого» градієнта концентрацій, а по-друге, при концентраціях, що перевищують 2 мМ, вона починає мимоволі полімеризуватися (Таматракольн, Хільдебранд, 2006). Щоб успішно транспортувати з води кремній, діатомеї повинні пов’язувати її з такими органічними молекулами, як білки.

«Основною формою кремнію в океані є кремнієва кислота (97%); решта припадає на частку силікатів. Оскільки діатомовим водоростям, чия чисельність в океані дуже велика, кремній життєво необхідний, саме вони впливають на його концентрацію в морській воді. Згідно з літературними даними, до появи діатомей та інших кремнистих організмів вода у Світовому океані була просто насичена кремнієм (1,7-2,5 мМ), сьогодні ж його концентрація впала до 70 мкМ і нижче, а в поверхневих водах — до 1 мкМ. Концентрація ж кремнієвої кислоти всередині діатомової клітини лежить в діапазоні 19-350 мМ. Таким чином, внутрішньоклітинна концентрація кремнієвої кислоти виявляється в тисячі разів вище позаклітинної! «

(Таматракольн, Хільдебранд, 2006, с. 64)

Невловимі SIT

Перші дані про потенційні білки-транспортери кремнію (silicon transporters — SITs) були опубліковані для морської діатомеї Cylindrotheca fusiformis наприкінці минулого століття (Hildebrand et al., 1997). Співробітникам Інституту океанографії Скриппса Каліфорнійського університету (Сан-Дієго, США) вдалося встановити нуклеотидну послідовність п’яти генів, що утворюють близькоспоріднене сімейство. Подальший аналіз передречених амінокислотних послідовностей дав підстави стверджувати, що ці білки є хорошими кандидатами на роль переносників кремнієвої кислоти (Hildebrand et al., 1998).

У діатомових водоростей розпізнають, зв’язують і транспортують кремнієву кислоту з навколишнього середовища особливі білки SIT. Потрапивши в клітку, кремнієва кислота транспортується в спеціалізовані везикули, де вона полімеризується, перетворюючись на створку нової клітини, яка потім виводиться з клітини назовні. По: (Thamatrakoln et al., 2006)

Після виходу цих робіт у групи вчених Лімнологічного інституту СО РАН під керівництвом академіка М. А. Грачова виникла ідея вивчити білки SIT у байкальських діатомів. В якості основного об’єкта досліджень був обраний вид діатомової водорості роду Synedra, широко поширеного в прісноводних водоймах.

На основі порівняльного аналізу амінокислотних послідовностей білків у двох видів — байкальської S. acus subsp. radians і морський C. fusiformis, розділених між собою еволюційною дистанцією в кілька десятків мільйонів років, передбачалося виявити елементи, які могли б входити до складу активного центру цих білків. В результаті увагу дослідників привернула послідовність CMLD, що являє собою так званий консервативний мотив, тобто коротку послідовність амінокислотних залишків, яка не зазнала змін у процесі еволюції. Прилеглі до цього мотиву ділянки також виявилися схожими у двох видів водоростей (Грачов та ін., 2002). Була висловлена гіпотеза, що цей мотив у білках SIT пов’язує іон цинку, який, у свою чергу, служить акцептором кремнієвої кислоти.

Білки-транспортери кремнію SIT у діатомових складаються з десяти пронизуючих плазматичну мембрану сегментів, з’єднаних гідрофільними петлями, і містять кілька консервативних мотивів CMLD і GXQ. Білки формують канали для проведення кремнієвої кислоти через непроникний для неї ліпідний шар мембрани. По: (Thamatrakoln et al., 2006)

Пізніше як в ЛІН СО РАН, так і за кордоном на основі вивчення генних послідовностей були отримані нові дані про амінокислотні послідовності білків SIT. Їх порівняльний аналіз показав значну варіабельність SIT-білків, проте їх гомологія при цьому була настільки очевидна, що могла свідчити про великий тиск природного відбору в процесі адаптації водоростей до умов середовища проживання.

Слідуючи гіпотезі походження діатомових водоростей від хризофітових, були зроблені спроби пошуку генів sit у водоростей з цієї групи, які увінчалися успіхом (Лихошвай та ін., 2006). Таким чином, стало ясно, що білки-транспортери кремнію мають дуже стародавню еволюційну історію, оскільки діатомові водорості з’явилися лише близько 240 млн років тому, а хризофітові — 600 млн років тому. Наявність у білках хризофітових мотиву CMLD стала ще одним аргументом на користь гіпотези про його важливу роль у функціонуванні цих загадкових білків.

Так виглядає ймовірна структура комплексу мотиву CMLD білка транспорту кремнію SIT з іоном цинку у діатомових водоростей. По: (Grachev et al., 2005). Ріс. В.Анєнкова (ЛІН СО РАН, Іркутськ)

У 2006 р. наші американські колеги, продовживши роботу на інших видах діатомей, висунули гіпотезу про роль у транспорті кремнію інших консервативних амінокислотних мотивів — GXQ, розташованих у трансмембранних (тобто вбудованих у клітинну мембрану) доменах білків SIT. Згідно з їхнім припущенням, залишок кремнієвої кислоти спочатку пов’язується з двома з цих послідовностей, розташованих із зовнішнього боку клітини. Слідом за цим білок SIT зазнає радикальної перебудови своєї третинної структури — цей конформаційний перехід нагадує вивертання парасольки, в результаті чого кремнієва кислота «відривається» від «зовнішніх» мотивів GXQ і пов’язується з мотивами, розташованими вже з внутрішнього боку клітинної мембрани. У результаті кремнієва кислота потрапляє в цитоплазму клітини.

Схема транспорту кремнієвої кислоти через мембрану клітини діатомової водорості за допомогою мотиву GXQ: кислотний залишок пов’язується з глутаміном (Q) мотивів GXQ, розташованих у фрагменті білкової молекули, спрямованому в зовнішнє середовище, викликаючи зміну форми білка SIT. У результаті кремнієва кислота зв’язується з глутаміном з внутрішньоклітинної гідрофільної петлі, таким чином потрапляє всередину клітини. По: (Thamatrakoln et al., 2006)

2008 р. ознаменувався своєрідним підбиттям підсумків досліджень у галузі білків-транспортерів кремнію: автори двох різних гіпотез незалежно один від одного узагальнили весь свій отриманий матеріал, навівши вагомі аргументи на користь тієї чи іншої гіпотези (Hildebrand, 2008; Grachev et al., 2008).

Ще раз відзначимо, що всі ці гіпотези були висунуті виключно на основі інформації, отриманої в результаті розшифровки фрагментів генів і невеликого числа повних генів, так як виділити сам білок SIT в чистому вигляді і провести його рентгеноструктурний аналіз досі не вдалося. Лише в 2007 р., через майже десятиліття після виявлення генів sit, іркутські, а потім американські дослідники підтвердили високочутливим методом імуноблоттингу реальну наявність білків SIT в протеомах декількох видів діатомових.

Вчені запропонували два альтернативні механізми взаємодії кремнієвої кислоти з SIT. Згідно з першим з них, кислота пов’язується з іоном цинку в активному центрі консервативного мотиву CMLD, який знайдено не тільки у більшості діатомів, а й у більш стародавніх хризофітових (Лихошвай та ін., 2006). Друга модель взаємодії заснована на зміні конформації самого білка-транспортера, за яку відповідають консервативні мотиви GXQ, розташовані в чотирьох різних районах білкової молекули.

(Thamatrakoln et al., 2006)

Правила множення генів

Завдяки зусиллям вчених з різних країн стало з’являтися все більше даних щодо структури генів sit у різних видів діатомей, проте найчастіше йшлося про їхні окремі фрагменти. Що стосується повнорозмірних генів, то інформація про них була значно розширена завдяки секвенуванню геномів двох морських діатомей — Thalassiosira pseudonana і Phaelodactilum tricornutum (Armbrust et al., 2004; Bowler et al., 2008).

Поставивши завдання секвенувати повну послідовність гена sit у байкальської синедри, дослідники з ЛІН СО РАН відразу зіткнулися з великими труднощами. У 2007 р. за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) зі специфічними праймерами («затравками» для синтезу комплементарного ланцюга ДНК) і секвенування за методом Сенгера в генетичному матеріалі водорості вдалося ідентифікувати протяжну послідовність цього гена, проте його стартовий кодон — трійка нуклеотидів, з якої починається процес синтезу білка в рибосоме, і так був нуклеотидний. Питання про «прочитання» повного гена sit у байкальської діатомеї кілька років залишалося відкритим.

Велике значення в подальшому пошуку зіграли новий метод культивування водоростей, «чистих» від бактерій та інших одноклітинних (Shishlyannikov et al., 2011) і проект розшифровки повного геному S. acus subsp. radians з використанням методів масового паралельного секвенування, що стартував в ЛІН СО РАН в 2008 р. Оскільки завдяки результатам секвенування інших видів діатомових вже було відомо про наявність у них відразу декількох генів sit, цей проект відкрив можливість «розібратися» як з числом і структурою шуканих генів, так і їх місцем розташування в геномі (до речі сказати, більше половини з відомих на сьогодні повних послідовностей генів sit були отримані завдяки «прочитанню» саме повних геномів).

У рамках цього проекту спільно зі співробітниками московського Центру «Біоінженерія» РАН досить швидко вдалося «зібрати» повні геноми мітохондрій і хлоропластів синедри (Ravin et al., 2010; Galachyants et al., 2012), однак ген sit все ще залишався невловимим. Нарешті, в 2012 р. при аналізі даних попередньої збірки повного геному S. acus subsp. radians було знайдено ділянку, де розташовувалася нуклеотидна послідовність, що мала лише точкові відмінності від раніше виявленої генної структури. Ця послідовність ДНК кодувала поліпептид, що містить всі характерні для білка SIT консервативні елементи, а також має стартовий залишок метіоніну на початку послідовності.

Таким чином, з’явилися всі підстави говорити про відкриття першого повнорозмірного гена sit у представника байкальських діатомових, що було підтверджено в спільній роботі з к. х. н. О. О. Бондарем з ЦКП «Геноміка» СО РАН (Новосибірськ).

Зрештою вдалося з’ясувати, що кластер генів sit у синедри складається з двох несподівано «довгих» генів, розташованих в одній ділянці хромосоми, — «подвоєнного» sit-td і «потроєного» sit-tri, довжина яких майже в 2 і 3 рази, відповідно, перевищує довжину всіх відомих повнорозмірних генів сімейства sit. У хромосомі ці гени розділені відстанню в кілька тисяч пар нуклеотидів. Кожен з них кодує, відповідно, 2 і 3 функціональні білкові одиниці SIT, що містять всі їх специфічні консервативні елементи.

Як показали дослідження іркутських лімнологів, кластер генів sit у байкальської діатомової водорості S. acus subsp. radians складається з двох генів різної довжини, розділених проміжком. Обидва гени мають один однаковий фрагмент («1В + 2»), при цьому більш довгий ген являє собою, по суті, копію першого гена + додаткову ділянку: «1A + 1V + 2». Фрагменти «1A» і «1V» дуже схожі між собою, але відрізняються від фрагмента «2». Така складність структури була одним з каменів спотикання для секвенування, особливо на етапі пошуку відповідної матричної РНК, так в цьому випадку неможливо було визначити, з одним або двома генами має справу дослідник. Тому для роботи з пулом комплементарної ДНК, отриманої з бібліотеки мРНК, потрібно було визначити точки початку транскрипції «зчитування») як для більш довгого гена sit-tri, так і для однакового фрагмента «1V + 2»

Відкриття генів sit у байкальської синедри породило і нові загадки: судячи з результатів вищезазначених імунохімічних досліджень, білки SIT у цієї водорості мають масу близько 66 кДа, але виходячи з розшифрованих генних послідовностей, їх маса повинна була перевищувати 92 і 110 кДа. Щоб перевірити, чи не є знайдені гени «псевдогенами» (не транслюваними), а також визначити довжину зчитуваної з генів матричної РНК, була отримана сумарна РНК клітин водорості, а на її основі — «бібліотека» комплементарної ДНК.

Виявилося, що в клітинах байкальської синедри дійсно присутні «довгі» мРНК, послідовності яких точно відповідають виявленим генам. Ця знахідка означає, що там теоретично могли б знаходиться і білки з дуже великою молекулярною масою, чого в реальності не спостерігається. Однак відповіді на питання, як і на якому етапі трансляції генетичної інформації відбувається «укорочення» мРНК і формування білків «звичайної» довжини, поки немає.

До 2015 р. у світі було ідентифіковано лише 15 повних послідовностей генів, які кодують білки транспорту кремнію, для шести видів морських діатомових водоростей. Через 13 років після початку в нашій країні подібних робіт вдалося відкрити і характеризувати перші повнорозмірні гени sit, що належать прісноводному представнику діатомей.

Будова панцирів діатомових водоростей. Скануюча електронна мікроскопія. Фото М. Башенхаєвої

Виявлений у байкальській S. acus subsp. radians кластер генів sit у вигляді «тандем + триплет» не зустрічався в жодної з уже досліджених діатомів, для яких характерна наявність 3-5 окремих генів sit «звичайної» довжини. Особливий інтерес викликає той факт, що «нестандартні» гени були виявлені у виду, що мешкає в прісноводному озері, що може бути пов’язано з пристосуванням до нових умов проживання.

Аналіз структурної організації генів, які кодують білки транспорту кремнію у діатомів та інших кремній-залежних організмів, дозволить зрозуміти, яким чином йшла еволюція цих унікальних білків. Без них одноклітинні водні організми не змогли б використовувати «шкідливий» кремній навколишнього середовища для «корисного» будівництва захисних панцирів і опорних міцних елементів екзоскелета. Нові організми, які з’явилися завдяки білкам-транспортерам і активно еволюціонували, змінили біосферу нашої планети.

Робота підтримана програмою Президії РАН «Молекулярна і клітинна біологія».

Література1

. Грачов М. А., Денікіна Н. Н., Бєліков С. І. та ін. Елементи активного центру білків транспорту кремнієвої кислоти в діатомових водоростях//Молекулярна біологія. 2002. Т. 36. № 4. С. 379-681.2.

Ліхошвай Є.В., Масюкова Ю.А., Щербакова Т.А., та ін. Виявлення гена транспорту кремнієвої кислоти у хризофітових водоростей//Докл. РАН. 2006. Т. 408. С. 845-849.3. A

rmbrust E. V., Berges J. A., Bowler C. et al. The genome of the diatom Thalassiosira pseudonana: ecology, evolution, and metabolism // Science. 2004. V. 306. P. 79–86.4. B

owler C., Allen A. E., Badger J. H. et al. The Phaeodactylum genome reveals the evolutionary history of diatom genomes // Nature. 2008. V. 456. P. 239–244.5. G

alachyants Y. P., Morozov Al. A., Mardanov A. V. et al. Complete Chloroplast Genome Sequence of Freshwater Araphid Pennate Diatom Alga Synedra acus from Lake Baikal // Intern. J. of Biol. 2012. V. 4(1). P. 27–35.6. G

rachev M. A., Annenkov V. V., Likhoshway Ye. V. Silicon nanotechnologies of pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. V. 30. P. 328–337.7. G

rachev M., Sherbakova T., Masyukova Yu. et al. A potentional Zinc-binding motif in silicic acid transport proteins of diatoms // Diatom Res. 2005. V. 20, № 2. P. 409–411.8. H

ildebrand M., Volcani B. E., Gassmann W. et al. A gene family of silicon transporters // Nature. 1997. V. 385. P. 688–689.9. H

ildebrand M., Dahlin K., Volcani B. E. Characterization of a silicon transporter gene family in Cylindrotheca fusiformis: sequences, expression analysis, and identification of homologs in other diatoms // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 260. P. 480–486.10.

Hildebrand M. Diatoms, Biomineralization Processes, and Genomics // Chem. Revi. 2008. V. 108. № 11. P. 4855–4874.11.

Ravin N. V., Galachyants Y. P., Mardanov A. V. et al. Complete sequence of the mitochondrial genome of a diatom alga Synedra acus and comparative analysis of diatom mitochondrial genomes // Curr. Genet. 2010. V. 56(3). P. 215–223.12.

Shishlyannikov S. M., Zakharova Y. R., Volokitina N. A. et al. A procedure for establishing an axenic culture of the diatom Synedra acus subsp. radians (Kutz.) Skabibitsch. from Lake Baikal // Limnol. Oceanogr.: Methods. 2011. V. 9. P. 478–484.