«Білок стромалін у дрозофіл обмежує запам’ятовування, знижуючи виділення сигнальних речовин»

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 68

Ріс. 1. Короткий виклад результатів роботи. Якщо в утворюючих дофамін нейронах центральної нервової системи дрозофіл Drosophila melanogaster експериментально заблокувати синтез білка стромаліну, то в місці їх контакту з іншими нервовими клітинами підвищується (порівняно з нормою) число мембранних бульбашок (везикул), заповнених нейромедіатором (дофаміном). Це підвищує ефективність передачі сигналів у таких синапсах і, як наслідок, навчання уникненню певних запахів (для цього дані запахи в експериментах асоціюються з ударами струму). Малюнок з обговорюваної статті в Neuron

У плодових мушок дрозофіл білок стромалін обмежує здатність до запам’ятовування інформації. Нове дослідження показало, за рахунок чого це відбувається. У нервових клітинах, що утворюють дофамін, стромалін «тримає у вузді» число синаптичних везікул — мембранних бульбашок з нейромедіаторами. Обмеження задається ще на ранніх етапах розвитку мушки і зберігається в зрілому віці. Цікаво, що стромалін не вплине ні на число нейронів, ні на кількість і топографію зв’язків між ними.

Останні 30-40 років вважається загальноприйнятою точка зору, що навчання на клітинному рівні проявляється в зміні зв’язків між нервовими клітинами — синапсів. Змінюватися може як кількість, так і міцність цих зв’язків. Одні синапси зникають, інші виникають заново. У хімічних синапсах може збільшуватися або знижуватися кількість виділених переносників сигналу, нейромедіаторів, у пресинаптичній мембрані і здатних сприймати їх білкових молекул — рецепторів — у постсинаптичній. Здатна змінюватися і площа контакту клітин, і його форма, і розташування.

Зміни кількості, будови і сили синаптичних зв’язків (тут і далі ми говоримо про хімічні синапси, але опускаємо слово «хімічний») відбуваються під дією досвіду, отримуваного організмом. Свіжі враження призводять до утворення нових контактів між нейронами, а невикористовувані синапси нерідко припиняють існування.

У регуляції пам’яті та навчання беруть участь гени і кодовані ними РНК. Існує цілий клас так званих «негайних ранніх генів» (immediate early genes), які активуються в перші хвилини і години після отримання нового досвіду — тобто практично відразу ж. Також при навчанні мають місце і більш повільні зміни в роботі нейронів. Але незалежно від їхньої швидкості набагато частіше говорять і суттєво більше знають про гени, що забезпечують запам’ятовування, ніж про гени, що обмежують його. Тим не менш, поступово з’являється нова інформація щодо генів-супресорів пам’яті (свою назву вони отримали за аналогією з генами-супресорами пухлин; див.: T. Abel et al., 1998. Memory suppressor genes: inhibitory constraints on the storage of long-term memory).

До генів-супресорів пам’яті відносять такі, «вимикання» яких призводить до посилення здатності запам’ятовувати. Багато з них обмежують зростання числа і площі синапсів, але для деяких супресорів пам’яті механізм дії невідомий. У дрозофіли — плодової мушки, у якої легко виробляється реакція уникнення певного запаху, якщо його поява супроводжується електричним ударом по лапках, — знайдено кілька десятків таких генів, і в їх числі — ген стромаліну (stromalin). Кодований ним білок входить в когезин — білковий комплекс, що регулює розбіжність хроматид в ході ділення клітин. Стромалін у складі когезину, а також кодуючі ці білки іРНК, у помітних кількостях знаходять у нервовій системі мишей і дрозофіл незважаючи на те, що клітини цих систем у дорослих тварин практично не діляться. (Варто врахувати, що у хребетних білки когезину і кодуючі їх гени називаються дещо інакше; про них можна докладніше почитати в статті Ю.Ф. Богданова Білкові механізми мейозу.) Експерименти на мухах показали, що когезин допомагає позбуватися «зайвих» відростків нервових клітин через нетривалий час після того, як ці нейрони сформувалися зі своїх попередників. Але що він робить в мозку, всі клітини якого мають вже досить солідний вік, було незрозуміло.

Автори обговорюваної статті вирішили перевірити, що саме зміниться в нервових клітинах дрозофіл Drosophila melanogaster, якщо заблокувати в них утворення стромаліну. Для цього вони вибрали представників декількох ліній і порушили в їх нервовій системі експресію гена стромаліну за допомогою РНК-інтерференції. Вчені перевірили ефективність цієї маніпуляції: витягли у мух головний мозок, заморозили його в рідкому азоті і нарізали на платівки товщиною 38-102 мікрометри. Ці зрізи пофарбували методами імуногістохімії, додавши в омиваючий їх розчин флуоресуючі антитіла до іРНК стромаліну. Вміст цієї іРНК в нервовій системі мух, до якої застосували РНК-інтерференцію, було знижено як мінімум на 50% порівняно з таким для контрольних тварин, чий стромалін «не чіпали».

Мух найчастіше навчають уникати запахів певних речовин, і про механізми такого уникнення відомо досить багато. Незбагненною пам’яттю у цих та інших комах «завідують» грибоподібні тіла — парні утворення в головних гангліях (рис. 2). За формою вони дійсно схожі на плодові тіла вищих грибів: кожне умовно ділиться на капелюшок і ніжку. У грибоподібних тілах присутні кілька груп клітин, серед них парні альфа-, бета- і гамма-групи. На багато з цих клітин антенальними нервами приходить інформація від нюшливих рецепторів: так муха розуміє, що вона чує. Крім того, грибоподібні тіла пов’язані з дофамінергічними нейронами, і показано, що вони відіграють важливу роль у запам’ятовуванні зв’язків певних запахів з неприємними стимулами (на кшталт удару струмом).

Ріс. 2. Схема нервових зв’язків, що забезпечують дрозофілі сприйняття запахів. Синім виділені грибовидні тіла. Не показані дофамінергічні нейрони, що забезпечують формування асоціацій запахів з конкретними явищами. Малюнок зі статті M. Heisenberg, 2003. Mushroom body memoir: from maps to models

РНК для інтерференції гена стромаліну вводили в різні частини центральної нервової системи дрозофіл. Попередні поведінкові експерименти показали, що здатність до запам’ятовування зростає тільки у тих мух, яким зробили ін’єкцію інтерферуючих РНК в грибовидні тіла або області розташування дофамінергічних нейронів, пов’язаних з цими тілами. «Вимикання» гена стромаліну в інших залучених до сприйняття запахів частинах нервової системи не змінювало ступінь навчаності мух. Тому далі працювали лише з такими комахами, у яких стромалін не працював у грибовидних тілах і пов’язаних з ними дофамінових клітинах.

Далі потрібно було з’ясувати, які зміни в поведінці дрозофіл тягне за собою блокування роботи стромаліну. Вироблення у дрозофіл пам’яті на запахи — добре відпрацьована методика, і в загальних рисах вона виглядає так: спочатку півхвилини дають комахам подихати конкретною речовиною, а потім пускають струм у решітки на підлозі тієї камери, в якій вони сидять. Через деякий час, зазвичай не більше доби після такого навчання перевіряють, що дрозофіли запам’ятали.

Однак, перш ніж тестувати пам’ять комах з «вимкненим» геном стромаліну, необхідно було зрозуміти, чи не змінилося у них в порівнянні з контрольними особами сприйняття запахів через РНК-інтерференції. Тому «експериментальним» дрозофілам давали понюхати розчинені в мінеральній олії 3-октанол і бензальдегід, неприємні для звичайних особин цього виду. Концентрації речовин підбирали для мух кожної лінії таким чином, щоб у контрольних тварин вони викликали приблизно однаковий ступінь відкидання. Антипредпоштення мух тестували в Т-подібному лабіринті: в основу пластикової камери у формі букви Т садили комаху, а вона повинна була повзти в один з рукавів-боків літери Т, в якому пахло 3-октанолом або бензальдегідом.

Під час описаних експериментів автори з’ясували, що дрозофілам з «вимкненим» геном стромаліну так само неприємні бензальдегід і 3-октанол, як і особам з контрольної групи. Не змінилися ні співвідношення комах, які вибирають той чи інший запах як менший з двох злий, ні концентрація, в якій потрібно було пред’являти мухам речовини для отримання поведінкової реакції уникнення. Протестували і чутливість дрозофіл до електрошоку. Вона біля мух з непрацюючим геном стромаліну теж не відхилялася від норми. Переконавшись у цьому, вчені змогли приступити до дослідів з навчання дрозофіл.

Навчання проводили за стандартною методикою: брали мух віком 1-6 днів після виходу з лялечки, розбивали на групи по 60 і саджали в спеціальні камери. Перші 30 секунд комахи дихали звичайним повітрям. Потім дрозофілам давали протягом хвилини нюхати 3-октанол або бензальдегід і паралельно від 1 до 12 разів подавали струм на підлогу камери, де знаходилися тварини. Після закінчення цієї хвилини на 60 секунд «вмикали» інший запах (наприклад, якщо в перший раз був бензальдегід, то в цей — 3-октанол), але струмом в цей час не били. Завершувався сеанс навчання 30 секундами подачі чистого повітря. Пам’ять про те, який з двох запахів пов’язаний з електрошоком, тестували в Т-подібному лабіринті (методика описана вище) через 3 хвилини після сеансу навчання, а потім — через 1, 3, 6, 12 і 24 години після нього, у кожної мухи — тільки в якийсь один термін з усіх названих.

Ріс. 3. Результати навчання дрозофіл з «вимкненим» геном стромаліну і комах з контрольної групи. Малюнок з обговорюваної статті в Neuron

Як і передбачалося, «вимикання» гена-супресора пам’яті призвело до її поліпшення. У дрозофіл без стромаліну підвищилася здатність запам’ятовувати інформацію, а здатність відтворювати її залишилася на тому ж рівні, що і у контрольних особин (рис. 3). Особливо сильно це проявлялося, якщо мух били струмом 5-6 разів; при більшому числі імпульсів відмінності між експериментальною групою і контролем були не настільки помітні. Якість відтворення вимірювали по тому, наскільки добре тварина пам’ятає зв’язок запаху і електричного розряду через різні проміжки часу, а ефективність запам’ятовування оцінювали, рахуючи, скільки разів достатньо вдарити дрозофілу струмом, щоб через 3 хвилини вона пов’язувала ці удари з присутнім під час них запахом. Чим менше розрядів струму для цього потрібно, тим вища ефективність запам’ятовування. При цьому врахували, що комахам контрольної групи для вироблення стійкої реакції на запах було потрібно більше ударів струмом, ніж мухам без стромаліну в грибовидних тілах і пов’язаних з ними дофамінергічних нейронах. На перших діяли 12 електричними імпульсами, на других — тільки шістьма. Ця поправка вже відображена в нижньому графіку на рис. 3.

Дофамінергічні нейрони пов’язані з різними групами клітин грибовидних тел. Треба сказати, що в ембріональному розвитку клітини цих група з’являються не одночасно. Першими утворюються нейрони гамма-груп, а клітини альфа- і бета-груп масово формуються після третьої ліньки — притому на стадії лялечки значна частина «гамма-нейронів» гине. Стромалін міг би обмежувати здатність до запам’ятовування, діючи тільки на деякі з цих зв’язків — скажімо, тільки на синапси між дофамінергічними нейронами і клітинами гамма-груп.

Дослідники з’ясували, на які саме контакти дофамінергічних нейронів впливає стромалін. Для цього вони використовували термочутливу систему для РНК-інтерференції. Керуючи температурою, за якої розвивалися личинки дрозофіл, вчені блокували вироблення стромаліну на різних стадіях їхнього життя: до лінек, після першої ліньки, після другої, третьої, на стадії лялечки тощо. Потім вони проаналізували здатність мух всіх груп асоціювати запах з ударом струму.

Виявилося, що найкраще вона розвинена у тих, у кого РНК-інтерференція мала місце в грибовидних тілах і дофамінергічних нейронах ще у ембріона і до середини розвитку лялечки (рис. 4). Трохи менше посилення пам’яті було виражено у особин, чий ген стромаліну у відповідних частинах ЦНС (центральної нервової системи) був неактивний починаючи з третьої ліньки. Якщо РНК-інтерференція мала місце в якийсь інший час, що не включає в себе стадію після третьої ліньки, дрозофіли запам’ятовували зв’язок запаху і струму не краще і не гірше контрольних особин. Звідси дослідники зробили висновок, що стромалін чинить найважливішу дію на дофамінергічні нейрони ЦНС дрозофіли на стадії після третьої ліньки. У цей момент активно йде утворення нейронів груп альфа- і бета-. Саме вони відіграють ключову роль у сприйнятті запахів у дорослих особин.

Ріс. 4. Вплив періоду «вимикання» гена стромаліну РНК-інтерференцією на здатність дрозофіл до запам’ятовування. Справа зверху показана температура інкубації личинок і лялечок, на кожній схемі відповідна температура виділена жирною рисою. L — larva (личинка), P — pupa (лялечка). Малюнок з обговорюваної статті в Neuron

Тепер можна було більш предметно говорити про те, що такого робить в дофамінергічних клітинах стромалін, що обмежує здатність до запам’ятовування. Як з’ясували автори в серії додаткових експериментів, надлишкове виробництво стромаліну нейронами не заважає мухам запам’ятовувати інформацію. Щоб з’ясувати, на які параметри фізіології та морфології дофамінергічних клітин впливає стромалін, вчені ввели групі дрозофіл в ЦНС різні флуоресцентні барвники, що дозволяють визначати концентрацію циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і іонів кальцію в цитоплазмі окремих нейронів. Названі речовини відіграють важливу роль у передачі сигналів між клітинами, і їх рівні змінюються, коли на тварину виявляється будь-який вплив, — наприклад, коли його б’ють струмом. Від зміни рівня іонів кальцію в цитоплазмі залежить збудливість клітини, тобто її здатність реагувати на зовнішні сигнали, а для циклічного АМФ відомо, що при активації нейронів грибовидних тіл дофаміном його концентрація в даних клітинах зростає.

Далі дослідники провели серію буквально ювелірних дослідів: мухам з флуоресцентними барвниками в ЦНС проробляли віконце в голові, щоб зовні було видно грибовидні тіла і пов’язані з ними дофамінергічні нейрони, і періодично били дрозофіл струмом по лапках. У ряді випадків замість цього безпосередньо активували дофамінергічні нейрони. Результати цієї серії показали (рис. 5), що рівень кальцію в нейронах грибовидних тіл при ударах струмом і при активації дофамінергічних клітин у мух без стромаліну значимо не відрізняється від такого у тварин контрольної групи. Однак при аналогічних впливах концентрація цАМФ в тих же клітинах виростала в два рази сильніше, ніж у звичайних комах. Тобто за відсутності стромаліну дофамін викликав у нейронах грибовидних тіл більш сильні відгуки — а стромалін, отже, обмежує передачу сигналів між цими клітинами і дофамінергічними нейронами нюшної системи.

Ріс. 5. Відповіді клітин грибовидних тіл на удари струмом по лапках дрозофіли. CFP, YFP — блакитний і жовтий флуоресцентні барвники. Tepac^vv — білок, що зв’язується з цАМФ і одним з флуоресцентних барвників (яким саме, визначається рівнем цАМФ). Порівнюючи інтенсивність флуоресценції CFP і YFP, визначають, як змінилася концентрація цАМФ (чим вона вища у CFP порівняно з YFP, тим більший приріст рівня циклічного АМФ). Сіро-блакитним на графіках показані дані по тваринах контрольної групи, сіро-фіолетовим — по тваринах з «вимкненим» геном стромаліну. Червоними прямокутниками відзначені моменти часу, коли на решітки в камерах подавали електричні розряди. Heel — «підошва», частина ніжки грибовидного тіла. MB — mushroom bodies, грибовидні тіла. DsRed — червоний флуоресцентний білок, GCaMP — зелений флуоресцентний барвник, що складається з декількох білків і виявляє іони кальцію, лід-gal4 — трансген для генетичних маніпуляцій з дофамінергічними нейронами. Малюнок з обговорюваної статті в Neuron

Посилене виділення цАМФ в нейронах грибовидних тіл у відповідь на удари струмом і пряму стимуляцію дофамінергічних нейронів могло свідчити про якісь зміни в будові клітин обох типів. Щоб виявити такі зміни, дослідники виготовили серії зрізів ЦНС дрозофіл, що містять ці нейрони. В одних зрізах за допомогою флуоресцентних барвників визначали кількість характерного для дофамінергічних нейронів різновиду синаптотагміну — білка, що бере участь у виділенні нейромедіатора. Якщо конкретніше, синаптотагмін допомагає везикулам з медіатором прикріплюватися до плазматичної мембрани і зливатися з нею. За іншими зрізами за допомогою мікроскопії структурованого освітлення (це один з видів мікроскопії надвисокої роздільної здатності) створювали тривимірні реконструкції дофамінергічних нейронів і їх синапсів з клітинами грибовидних тіл.

Ця частина роботи виявила, що за відсутності стромаліну у дрозофіл не змінюються число і щільність дофамінергічних нейронів, пов’язаних з клітинами підошв грибовидних тіл, розташування синапсів між нейронами названих груп і середня площа цих синапсів. Однак синаптотагміна в дофамінергічних клітинах у мух з «вимкненим» геном стромаліну стабільно виявляли більше, ніж у тваринних «контролів». А це непряма ознака того, що в місцях контакту даних клітин з нейронами грибовидних тіл частіше відбувається виділення нейромедіатора з везикул.

Знайшовся і прямий доказ цього факту. Реконструкції показали, що мембранних бульбашок з дофаміном в синапсах дофамінергічних клітин з клітинами грибовидних тіл більше, якщо ген стромаліну не працює. Те, що ці везикули містять саме дофамін, визначили за їх будовою: у мембранних бульбашок з дофаміном і схожими по будові молекулами всередині є електронноплотне ядро (dense core), яке на препаратах для електронної мікроскопії виглядає чорним. Всі ці результати представлені на рис. 6.

Ріс. 6. Вплив «відключення» гена стромаліну на число і розмір синапсів між дофамінергічними клітинами і нейронами підошв грибовидних тіл дрозофіли. А — схема грибовидного тіла і пов’язаного з ним ганглія PPL1, де розташовані тіла дофамінергічних нейронів. Помаранчевим виділені ці нейрони і клітини в підошві (heel) грибовидного тіла, з якими вони взаємодіють. B, ліворуч — електронна мікрофотографія зрізу грибовидного тіла на рівні підошви (обведена помаранчевим); Довжина масштабного відрізка — 5 мкм. B, праворуч — електронна мікрофотографія відростків дофамінергічних нейронів (виділені блакитним), фарбування пероксидазою хріна (HRP, horseradish peroxidase). DCV — dense core vesicles, електронноплотні везикули з дофаміном. AZ — active zones, активні зони синапсів, в них відбувається виділення нейромедіатора. Довжина масштабного відрізка — 250 нм. З — тривимірні реконструкції тих же синапсів у мух з контрольної групи (ліворуч) і позбавлених стромаліну (праворуч). Видно, що у других в синаптичних закінченнях значно більше везикул. D — представлення цього результату у вигляді таблиці. Neuropil — нейропіль, скупчення нервових клітин (в даному випадку — в підошві грибовидного тіла), SV — synaptic vesicles, синаптичні везикули без ущільнень. Довжина масштабного відрізка — 150 нм. Малюнок з обговорюваної статті в Neuron

Останнє, що залишилося з’ясувати — чи існує зв’язок між здатністю дрозофіл до запам’ятовування і кількістю везикул з дофаміном в досліджуваних синапсах. Для цього у групи мух у дофамінергічних нейронах «вимкнули» ген unc104, чий білок відповідає за переміщення мембранних бульбашок з нейромедіаторами в місця контакту клітин. У половини цих комах ген стромаліну працював, у половини — ні. Всі дрозофіли в даному експерименті були практично ненавчальними. Звідси дослідники зробили висновок, що число везікул в синапсах між дофамінергічними клітинами важливо для запам’ятовування зв’язку конкретного запаху і ударів струмом. А дія стромаліну на пам’ять обумовлена тим, що він це число обмежує.

Виникає питання: навіщо потрібно знижувати здатності організму до запам’ятовування, чому існують такі природні «обмежувачі пам’яті», як стромалін? Найімовірніше, це і подібні йому речовини служать запобіжниками, які не дають нейронам проявляти зайву активність. Немає сенсу звертати багато уваги на інформацію, яка не має практичного значення (принаймні для мух це так), але потрібно зосереджуватися на важливих для виживання речах. Крім того, не всяке виділення нейромедіатора сприяє навчанню. Чимала частина сигналів від нейронів запускає скорочення м’язів, і, якщо такі скорочення відбуватимуться занадто часто або виявляться надлишково сильними, можуть виникнути судоми. Саме це відбувається при епілепсії. До речі, можна припустити, що дане дослідження стромаліну допоможе людям з цим захворюванням. Ймовірно, принаймні у частини хворих на епілепсію напади викликані надлишком нейромедіаторів у синапсах нейронних контурів, що керують тонусом м’язів і рухами. Можливо, підвищення рівня стромаліну або цілого когезину в них допоможе пацієнтам.

Джерело: Anna Phan, Connon I. Thomas, Molee Chakraborty, Jacob A. Berry, Naomi Kamasawa, Ronald L. Davis. Stromalin Constrains Memory Acquisition by Developmentally Limiting Synaptic Vesicle Pool Size // Neuron. Available online 28 November 2018. DOI: 10.1016/j.neuron.2018.11.003.

Світлана Ястребова