Ембріони та артеріальна гіпертензія

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 59

Про авторів

Сергій Якович Амстиславський — доктор біологічних наук, завідувач сектору кріоконсервації та репродуктивних технологій Інституту цитології та генетики СО РАН. Область наукових інтересів — збереження генетичних ресурсів тварин, механізми регуляції артеріального тиску у гіпертензивних щурів, вплив репродуктивних технологій на прояв генетично обумовлених властивостей нащадків.

Діана Сергіївна Рагайова — аспірант того ж сектора. Вивчає механізми формування артеріальної гіпертензії та віддалені ефекти тривалого культивування ембріонів ссавців in vitro.

Євген Юрійович Брусенцев — аспірант того ж сектора. Галузь наукових досліджень — адаптація репродуктивних технологій до різних видів ссавців, вивчення репродуктивних бар’єрів і способів їх подолання.

Тетяна Миколаївна Ігоніна — кандидат біологічних наук, молодший науковий співробітник того ж сектора. Спеціалізується на дослідженні переваг ембріонів щурів, схильних до розвитку артеріальної гіпертензії, а також на вивченні нащадків, які народилися в результаті застосування допоміжних репродуктивних технологій.

Допоміжні репродуктивні технології (ВРТ) об’єднують різні методи подолання безпліддя, при яких окремі або всі етапи зачаття і раннього розвитку ембріонів проходять поза організмом матері. Загальна кількість дітей, які народилися завдяки бурхливому розвитку цієї галузі медицини за більш ніж 35 років з часу першого успішного застосування ВРТ, перевищила 5 млн. На жаль, впровадження в практику нових технологій не завжди супроводжується ґрунтовними лабораторними дослідженнями.

Початковий варіант екстракорпорального запліднення був спрямований головним чином на подолання жіночого безпліддя [1]. Поза організмом запліднювали яйцеклітину (змішанням суспензій яйцеклітин і сперматозоїдів), а потім вводили отриманий ембріон для подальшого розвитку назад у репродуктивні шляхи матері.

Сучасний же комплекс ВРТ включає в себе також внутрішньоматкову інсемінацію (штучне введення насіння в жіночі статеві шляхи); ін’єкцію сперматозоїдів, у тому числі — відібраних за морфологічними ознаками, в цитоплазму яйцеклітини; дозрівання ооцитів in vitro; ^{кріоконсервацію1} гамет і переваг (до їх впровадження в матку, тобто до імплантації) ембріонів; трансплантацію останніх та ін. Особливе місце в цьому списку займає культивування переваг [2].

Завдяки вдосконаленню культуральних ^серед2, в клініках екстракорпорального запліднення все частіше виробляють трансплантацію зародків на більш пізніх стадіях розвитку.

Культивування ембріонів

Після того як запліднення завершилося і утворилася зігота, зародки ссавців (в тому числі і людські) починають дробитися. Перші три цикли ділення зіготи людини проходять у яйцеводах на другий і третій день після запліднення — в результаті зародок стає восьмиклітинним. Саме на цій стадії ембріони людини традиційно і досі пересаджують у багатьох клініках. На четвертий день розвитку відбуваються важливі зміни: завершується ще один цикл ділення клітин, вони втрачають сферичну форму і щільно примикають один до одного. Це стадія морули, після її досягнення зародок людини, як і більшості інших ссавців, переміщується в матку. У матці на п’ятий день розвитку, пройшовши ще один цикл ділення, морула перетворюється на бластоцисту (яка на сьому добу вагітності впроваджується в стінку матки). Зараз все більше клінік вибирають для трансплантації саме бластоцисти.

Ріс. 1. Переваги ембріонів. Клітини морул (а — щури лінії OXYS, б — людини) компактизовані, вони відійшли від прозорої оболонки, яка захищає ембріон, виконує бар’єрні функції і забезпечує обмін речовин з навколишнім середовищем. Бластоцисти (в — щури лінії OXYS, г — людини) містять бластоцель (заповнену рідиною порожнину), внутрішню клітинну масу (дрібні круглі клітини, з яких розвинуться тканини та органи майбутнього плоду) і трофобласть (сплощені бластомери, що вистилають зсередини прозору оболонку). Все більше клінік вибирає саме бластоцисти для трансплантації ембріонів людини. Фото авторів (а, в) та Д. В. Нікіфорова (б, г)

Цікаво, що людський зародок за темпами розвитку дуже нагадує мишачий і щурячий (рис. 1). У цих лабораторних гризунів, як і у людини, перевагоплантаційний період проходить досить динамічно. У мишей і щурів міграція зародків в матку відбувається на третю добу, а вже на п’ятий день вагітності, пройшовши стадію морули, бластоциста впроваджується в стінку матки. У багатьох інших ссавців ці процеси займають більше часу. Наприклад, у кішки зародок виходить в матку на стадії морули (рис. 2) лише на шостий день, а імплантується на 11-й день вагітності. А у горностая ембріон опиняється в матці на 11-й день після запліднення і продовжує вільно там переміщатися ще довгих дев’ять місяців до імплантації.

Рис, 2. Морула кішки. Фото Т.О. Абрамової

Як показано в дослідах на тваринах, тривале культивування ембріонів in vitro іноді призводить до стійких змін фенотипу нащадків, народжених після трансплантації зародків. У ранніх експериментах О.Макларен і її колег мишата, які розвинулися з переваг ембріонів, культивованих зі стадії восьми клітин до бластоцисти і потім пересаджених в організм прийомної матері (реципієнта), важили менше, ніж дитинчата, народжені природним шляхом [3]. У цих дослідженнях ембріони вирощували в синтетичному живильному середовищі, далекому від оптимальної для розвитку мишачих зародків, адже в той час занадто мало було відомо про їхні потреби під час переважного розвитку. Багатьох потрібних речовин таке середовище не містило, тому зростання ембріона проходило гірше, ніж у природних умовах. Згодом вдалося досягти того, що нащадки, народжені внаслідок трансплантації мишачих ембріонів, які досить тривало культивувалися, мали нормальну масу [4].

Інший феномен, який здобув широку популярність, — поява великих новонароджених. Біотехнологи, які займалися трансплантацією вирощених у штучних умовах ембріонів овець і великої рогатої худоби, помітили, що народжені після таких процедур дитинчата мали значно більшу масу порівняно з телятами і ягнятами, що з’явилися на світ природним шляхом [5]. Тоді використовувалося напівсинтетичне живильне середовище з додаванням фетальної сироватки великої рогатої худоби. Вона містить безліч активних речовин, включаючи різні фактори росту, дози яких не піддаються вимірюванню. Саме тому розвинені з таких ембріонів тварини мали в деяких випадках збільшену масу тіла при народженні.

При відмінності між мишами і вівцями в фенотипічному прояві наслідків тривалого культивування, загальним для них було те, що змінювалася експресія деяких ключових для ембріонального розвитку генів. Це пов’язують з порушенням процесів метилування ДНК і в результаті — з порушенням виборчого інактивування, «вимикання» генів [5, 6]. Так, при культивуванні ембріонів овець у середовищах, що містять фетальну сироватку, рівень метилювання генів, які кодують рецептори до інсуліноподібного фактору росту II типу, був сильно знижений, а цим легко пояснити народження великих дитинчат [6]. У дослідженнях на мишах підтвердили, що при культивуванні зародків у штучних умовах порушується процес виборчої інактивації батьківських алелей деяких генів. В одних поживних середовищах ці порушення були яскраво виражені, тоді як в інших — фактично відсутні [7].

Ефекти культивування ембріонів in vitro традиційно сприймаються як негативні, проте з появою нових середовищ, що враховують потреби зародків, а головне, після виявлення позитивного впливу на них факторів зростання (детальніше про це — в останньому розділі) ситуація змінилася. Переважний ембріон тепер можна піддати впливу різних речовин, наприклад, дозованим впливом деяких ростових факторів. Ймовірно, вони могли б пом’якшити прояв певних генетично обумовлених захворювань. Щоб зрозуміти це, слід згадати про епігенетику. Інформація, закодована в генах, може бути реалізована по-різному залежно від того, як проходить ранній онтогенез. Отже, культивований переважний зародок, будучи найбільш раннім етапом розвитку ссавців, надає унікальні можливості для терапевтичного впливу. Воно може мати сильні і тривалі наслідки при формуванні фенотипу, коли з цього ембріона розвинеться доросла особина. Так можна шукати спосіб пом’якшити або відстрочити прояви генетично обумовлених захворювань, наприклад, артеріальної гіпертензії (гіпертонії).

Артеріальна гіпертензія

Гіпертонією в розвинених країнах страждає 20-30% дорослого населення. Чим старше вікова група, тим вище поширеність захворювання; в деяких країнах у літніх людей вона досягає 50-60% [8]. Хворими на гіпертонічну хворобу вважаються люди з тривалим і стійким підвищенням артеріального тиску, у яких під час систоли воно перевищує 140 мм рт. ст., а під час діастоли — 90 мм рт. ст. Вже в 2000 р. у світі було близько мільярда гіпертоніків, а до 2025 р., за прогнозами, їх кількість перевищить 1,5 млрд.

Стрес — найважливіший фактор, що провокує есенціальну (первинну) гіпертензію у людини. У сучасному суспільстві люди часто піддаються різним видам стресу: емоційному, соціокультурному та професійному. Є підстави вважати, що це призводить до періодів підвищення артеріального тиску, а як наслідок — до виникнення гіпертонії [9]. Одним з основоположників ^{психосоматичного напрямку} в медицині — Францем Александером — була виділена група класичних психосоматичних захворювань, куди увійшла і артеріальна гіпертензія. Ця патологія часто розвивається під час життєвих ситуацій, що супроводжуються тривогою, страхом, занепокоєнням, розгубленістю, прихованим гнівом і придушенням агресії. У гіпертоніків часто виникає відчуття хронічної нестачі часу, для багатьох з них характерний безперервний контроль над зовнішніми проявами своїх почуттів.

Провідна роль у гіпертензивних реакціях на стрес визнається за симпатичною нервовою системою, а також ренін-ангіотензиновою. Базовий механізм, за допомогою якого організм піднімає артеріальний тиск, — вазоконстрикція (звуження просвіту судин), що відбувається при посиленні тонусу симпатичної нервової системи. Вазоконстрикцію забезпечують альфа-1-адренорецептори, розташовані на артеріолах. До підвищення тиску мають відношення як власне нейрони симпатичної нервової системи, що виділяють норадреналін, так і мозкова речовина надниркових працівників, яка продукує ще й адреналін. Обидва ці компоненти формують так звану симпатоадреналову систему, яка активується в ситуації гострого стресу, що вимагає (принаймні в дикій природі) негайних фізичних дій. В таких умовах підйом артеріального тиску сприяє адекватній фізичній відповіді — боротьбі з конкурентами і хижаками, а якщо противник набагато сильніший, то і стрімкому відступу. У схильних до гіпертензії людей розвивається потужна емоційна відповідь на ситуацію, що сприймається ними як негативну або потенційно небезпечну, проте фізичної розрядки, як правило, не відбувається. Повторювані ситуації із звуженням судин без «скидання енергії» з часом можуть призвести до гіпертонії (недарма її називають «хворобою невідреагованих емоцій»).

Ренін-ангіотензинова система відіграє ключову роль у регуляції артеріального тиску. Ренін — це протеолітичний фермент, що утворюється в нирках. Його продукція залежить від тиску в артеріолах, а також від інших факторів, у тому числі симпатичного тонусу. Під дією реніна ангіотензиноген плазми крові перетворюється на ангіотензин I, а той завдяки ангіотензинпревращающему ферменту — в активну судинну речовину ангіотензин II, що викликає підвищення тиску. Переважна більшість препаратів проти гіпертензії — це інгібітори ангіотензинпревращающего ферменту, хоча останнім часом з’явилися і антагоністи рецепторів ангіотензину II. Підтвердження того, що стрес може призводити до збудження ренін-ангіотензинової системи, було отримано в дослідах над щурами. Їх залишали в клітці, випускаючи зовні голодного кота, який лякав гризунів своєю присутністю протягом півгодини. Після цього у випробуваних щурів підвищувався вміст реніна в крові [10]. Цікаво, що на людину кішки діють інакше. У господарів кішки в її присутності у відповідь на провокуючі ситуації істотно менше піднімається артеріальний тиск, а потім — швидше нормалізується [11].

Крім нейроендокринних механізмів у підйомі тиску і формуванні гіпертонії бере участь і імунна система. Так, при використанні імуносупресантів або у тварин з пригніченим імунітетом це захворювання повною мірою не розвивається. Вважається, що провокуючі його фактори, такі як стрес, активують нейронні мережі головного мозку, що беруть участь у підвищенні тонусу симпатичної нервової системи. Це призводить як до посилення вазоконстрикції, так і до активації імунної системи. Виокремлювані Т-лімфоцитами провоспальні цитокіни, своєю чергою, посилюють симпатичний судинний тонус.

Найважливіший маркер хронічного стресу — підвищена секреція гормонів коркового шару надниркових шарів, глюкокортикоїдів. Вони мають різноманітний вплив на організм, у тому числі збільшують чутливість адренергічних рецепторів кровоносних судин до дії норадреналіну та адреналіну, що може сприяти розвитку гіпертензії. У людини основний глюкокортикоїд — кортизол. Зміна його рівня в умовах психологічного стресу вище у тих, хто схильний до гіпертензії. Крім того, підвищений рівень кортизолу виявили у схильних до гіпертонії дітей, причому ще до того, як вона у них виникла. У 30% випадків есенціальної гіпертензії має місце підвищений рівень кортизолу в крові.

Американські кардіологи М. Фрідман і Р. Розенман описали зв’язок між схильністю людини до гіпертензії і його поведінкою. Люди типу А, або коронарні особистості, частіше зазнають серцево-судинних захворювань (таких як інфаркт міокарда, стенокардія, атеросклероз), ніж особи протилежної категорії — типу Б. Поведінка типу А характеризується нетерпінням; прагненням до домінування, досягнень і змагання; схильністю працювати на знос; невмінням відпочивати. Таким людям притаманна підвищена тривожність, а часто і прихована агресивність. Гіпертоніки часто належать саме до типу А. Однак питання, чи причина хвороби така поведінка або результат гіпертензії, що вже сформувалася, поки залишається відкритим.

Моделі артеріальної гіпертензії

Оскільки дослідження на людях пов’язані з різного роду обмеженнями (в тому числі етичними), роль стресу і певних типів поведінки у формуванні артеріальної гіпертензії вивчають на тварин — переважно на щурах і рідше на мишах. Гіпертензивним порогом у лабораторних тварин більшість дослідників визнає 150 мм рт. ст. [12]. Перша експериментальна модель артеріальної гіпертензії була розроблена Г. Гольдблаттом з колегами. Вони викликали ішемію (місцеве зниження кровопостачання) нирок у собак, наклавши на ниркові артерії спеціальні затискі і залишивши їх у тілі тварин після операції. У прооперованих собак артеріальний тиск суттєво піднявся, причому майже у всіх він перевищив 200 мм рт. ст. Пізніше цю модель успішно застосували до кроликів, щурів і навіть козів та вівців [13]. Вибір таких великих ссавців, як собаки, кози та вівці, для досліджень гіпертонії пояснювався тим, що у них можна простіше і надійніше поміряти тиск. З розвитком відповідної техніки частіше почали використовувати щурів. Їх легко утримувати в сучасному віварії, і вони досить великі, щоб у них можна було легко зняти потрібні свідчення. Незважаючи на те, що мишей розводити ще простіше, міряти у них артеріальний тиск складніше в силу їх меншого розміру. У 1990-1997 рр. кількість досліджень у галузі гіпертензії, проведених на щурах, у сотні разів перевищувала кількість робіт, виконаних на всіх інших лабораторних тваринах, включаючи мишей [13].

Рис, 3. Вимірювання артеріального тиску у щура лінії ISIAH (модель артеріальної гіпертензії) непрямим методом. Перегляд зверху на установку. Тут і далі фото авторів

Існує більше десятка добре охарактеризованих ліній щурів, визнаних у світі генетичними моделями артеріальної гіпертонії [12, 13]. У спонтанно гіпертензивних щурів лінії SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) є прояви, схожі на есенційну гіпертензію людини, це найвідоміша у світі генетична модель цього захворювання [13]. В Інституті цитології та генетики СО РАН у Новосибірську професором А.Л. Маркелем була створена відповідна вітчизняна модель. Він ще в 1970-х роках почав виводити нову лінію щурів, ґрунтуючись на визнанні ролі стресу в розвитку гіпертонії. Як селекційний критерій використовувався підйом артеріального тиску в умовах м’якого емоційного стресу [14]. Тварин на 30 хв поміщали в тісні дротяні клітини, які якраз відповідають їх розміру. Деякі з випробовуваних реагували на таке обмеження свободи підйомом тиску — вони і стали засновниками нової гіпертензивної лінії. Вона отримала міжнародне визнання і відома як ISIAH (Inherited Stress-Induced Arterial Hypertension, або спадкова стрес-індуційована артеріальна гіпертензія). Кров’яний тиск дорослих особин таких щурів при стресі зазвичай вище 200 мм рт. ст., при цьому в спокої він становить близько 170 мм рт. ст., що теж істотно перевищує поріг гіпертензії (150 мм рт. ст.). Нещодавно нашими зусиллями щури лінії ISIAH були переведені в SPF-статус⁴. Їхня фізіологія і поведінка досить добре вивчені [12, 14]. Те, що критерієм селекції була їх гіпертензивна реакція на емоційний стрес, робить досить переконливою екстраполяцію експериментальних результатів, отриманих на цій лінії, на людину, оскільки і у людей цей фактор — найважливіший, якщо не головний для виникнення есенціальної гіпертензії.

Артеріальний тиск у щурів вимірюють прямим (інвазивним) і непрямим методами. Перший застосовують значно рідше, оскільки канюлювання артерій і непрямий метод дають подібні результати, а завдяки останньому вдається уникнути хірургічного втручання і не заподіювати тварині серйозних незручностей. Класичний непрямий метод — сфігмографічний (рис. 3), коли на хвіст надягають манжету і нагнітають в неї повітря, а спеціальним датчиком реєструють пульс у хвостовій артерії. Це дуже схоже на відомий всім метод вимірювання артеріального тиску у людини за допомогою тонометра. У своїх дослідженнях на щурах ми використовуємо саме сфігмографічний метод [12].

Поведінкові тести

Стан стресу у тварин супроводжується специфічною поведінкою. Для його вивчення в лабораторних умовах застосовують спеціальні тести. Їх існує близько ста, причому експериментатор повинен сам вирішити, які саме вибрати, виходячи з цілей і завдань свого дослідження [15]. Ми використовували панель з трьох класичних поведінкових тестів («відкрите поле», «піднесений хрестоподібний лабіринт» і «світлу-темну камеру»), що дозволяють оцінити активність, дослідницьку мотивацію, а також рівень тривожності та емоційності щурів.

Рис, 4. Щур у транспортувальній судині (ліворуч) і в тесті «відкрите поле» демонструє одну з найбільш загадкових і складно інтерпретованих форм поведінки — грумінг

У використаній нами модифікації тесту «відкрите поле» проводилася автоматична реєстрація горизонтальної і вертикальної активності щура. Підраховувалася кількість пересічених квадратів за весь час тесту — 6 хв (горизонтальна активність), оцінювалися число вставань на задні лапи і сумарний час, проведений гризуном в цьому стані (вертикальна). Особливе значення також має тривалість перебування тварини в центрі відкритого поля. Ці показники характеризують загальну активність і дослідницьку мотивацію. У тесті «відкрите поле» можна спостерігати й інші компоненти поведінки, наприклад, ^{грумінг5} (рис. 4). Його зазвичай інтерпретують як зміщену активність — одна з ознак тривожності. Загалом за поведінкою в цьому тесті можна скласти уявлення про те, чи схильний щур до станів тривоги і стресу, наскільки він активний, чи є у нього виражена дослідницька мотивація тощо. Однак більш повну картину поведінкового фенотипу гризуна можна отримати, поєднуючи тест «відкрите поле» з іншими, такими як «хрестоподібний лабіринт» і «світла-темна камера».

Рис, 5. Щур демонструє дослідницьку поведінку в тесті «хрестоподібний лабіринт»

У тісті «піднесений хрестоподібний лабіринт» тварину поміщають на майданчик, від якого під прямими кутами розходяться відкриті і закриті рукави (рис. 5). Реєстровані показники — латентний період виходу у відкритий рукав, час перебування і число заходів у закриті і відкриті рукави, а також кількість стійок, виглядань вниз з лабіринту («оцінка ризику») і актів дефекації. Цей тест дозволяє оцінити рівень тривожності випробовуваних та їх загальну активність і допомагає в інтерпретації результатів тесту «відкрите поле».

Рівень тривожності гризунів додатково оцінюється в тесті «світла-темна камера», який заснований на їх конфлікті між вродженим неприйняттям яскраво освітлених ділянок і спонтанною дослідницькою поведінкою при слабкому стресі (рис. 6). Експериментальна установка складається з двох відсіків — темно