Інсулін «у таблетках» пройшов перевірку на щурах

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 60

Ріс. 1. Модель молекули інсуліну людини, отримана за допомогою рентгеноструктурного аналізу. Червона спіраль на передньому плані — це B-ланцюг, за нею, теж червона, A-ланцюг. Зелені — N- і C-кінці поліпептидних ланцюгів (N-кінець — це частина молекули, де стирчить аміногрупа першої амінокислоти, C-кінець — це закінчення молекули, де стирчить карбоксильна група). Зображення зі статті: V. I. Timofeev et al., 2010. X-ray investigation of gene-engineered human insulin crystallized from a solution containing polysialic acid

Спроби замінити ін‘єкції інсуліну таблетками почалися ще кілька десятиліть тому. Однак досі жоден препарат не вийшов на масове виробництво. Вчені з Гарвардського університету (США) і Каліфорнійського університету в Санта—Барбарі розробили капсули з інсуліном у вигляді іонної рідини, які знижують рівень глюкози в крові на тривалий період. Тепер дослідники хочуть отримати схвалення на клінічні випробування за участю людей.

У живих організмах постійно відбувається величезна кількість хімічних реакцій, які спрямовані на підтримку життя. Сукупність цих реакцій прийнято називати обміном речовин, або метаболізмом. Всі хімічні перетворення можна поділити на два типи: реакції, в ході яких складні органічні речовини розщеплюються на більш прості, і реакції, в результаті яких утворюються складні молекули з простих.

Один з регуляторів обміну речовин — білковий гормон інсулін (рис. 1), основна функція якого — зниження рівня глюкози в крові. Інсулін запускає механізм поглинання глюкози клітинами, зв’язуючись з рецепторами на їх поверхні. Пізніше, ця глюкоза буде використовуватися клітинами за призначенням. Наприклад, у процесі гліколізу з однієї молекули глюкози вийде дві молекули піровіноградної кислоти. Також інсулін здатний запустити процес утворення жирів з глюкози в спеціальних жирових клітинах — адіпоцитах (G. Dimitriadis et al., 2011. Insulin effects in muscle and adipose tissue).

Інсулін синтезується бета-клітинами — особливими клітинами, розташованими в підшлунковій залозі. Будова інсуліну дуже проста: 51 амінокислота утворює два поліпептиді ланцюги — A і B. A-ланцюг містить 21 амінокислотний залишок, а в B-ланцюгу таких залишків 30.

Про цей гормон можна сміливо сказати «малий, хай удав», оскільки інсулін, один з найменших серед білкових гормонів за розміром і кількістю амінокислот, бере участь у великій кількості процесів в організмі (для порівняння: гормон росту — соматотропін — має у своєму складі 191 амінокислоту, а гормон передньої частки гіпофізу пролактин — 199 амінокислот). Один з цих процесів всім дуже добре відомий: інсулін здатний знижувати кількість глюкози в крові. Справа в тому, що велика кількість цукру в крові загрожує наслідками: зайвий цукор може глікозилювати білки крові, наприклад гемоглобін, через що гемоглобін починає гірше виконувати свої функції, тобто гірше транспортувати кисень і вуглекислий газ. При підвищеному цукрі також змінюється в’язкість крові.

Ну і щоб читач остаточно переконався, що підвищений цукор у крові — це погано, пропоную пошукати в інтернеті вираз «діабетична стопа». Ми постійно отримуємо мікропошкодження на стопі. При неконтрольованому цукровому діабеті порушується цілісність судин кінцівок, а чутливість у цих зонах зменшується. Що ми маємо на виході? У мікропошкодженнях накопичується невелика кількість крові. І якщо звичайну кров бактерії не дуже люблять, так як там повно клітин, які їх вбивають, то в ситуації з солодкою кров’ю ситуація змінюється. У підсумку ми отримуємо рани на ступнях, які кишать бактеріями, а оскільки чутливість зменшилася — людина навіть не відчуває больових відчуттів.

Як інсулін зменшує кількість глюкози в крові? Разом з кров’ю інсулін і глюкоза приходять до різних клітин наших органів. Далі гормон зв’язується з рецепторами на поверхні мембрани клітин. Це зв’язування запускає роботвуглюкозних транспортерів — великої групи мембранних білків, завдання яких — перенести глюкозу через мембрану із зовнішнього простору всередину клітини. Також інсулін активує перетворення солодкої мономерної глюкози на глікоген. Глікоген — це полімерна молекула, яка складається з пов’язаних між собою залишків глюкози. Нова будова — нові властивості. Полімерна молекула несолодка і нерозчинна у воді, а значить, не впливає на хімічні реакції, які відбуваються навколо. Полісахарид може спокійно лежати в сторонці до кращих часів. Саме у формі глікогену глюкоза довгий час зберігається в організмі, створюючи запас на майбутнє. За аналогією з крохмалом у рослин, глікоген може утворювати гранули в цитоплазмі. Як тільки клітині знадобиться енергія, а вільної глюкози не опиниться «під рукою», зв’язки в полісахариді розріжуть ферменти і з’явиться мономер.

При порушеннях у роботі інсулінової системи розвивається цукровий діабет — хронічне захворювання ендокринної системи. Є два типи цукрового діабету:

1-й тип: підшлункова залоза виробляє недостатню кількість інсуліну;

2-й тип: взаємодія клітин організму з інсуліном порушена (докладніше про діабет 2-го типу ви можете прочитати в новині Мікрофлора кишечника впливає на схильність до аутоімунних захворювань, «Елементи», 24.04.2013).

Патології у вуглеводному обміні становлять серйозну проблему сучасності. Кількість хворих на цукровий діабет зростає щороку. За даними ВООЗ, кількість людей з діабетом зросла зі 108 мільйонів у 1980 році до 422 мільйонів у 2014-му. Тільки за 2015 рік діабет забрав життя близько 1,6 мільйонів осіб; для порівняння, того ж року в ДТП загинуло приблизно 1,3 мільйонів осіб (див.:10 провідних причин смерті у світі).

Приблизно 10-15% випадків цукрового діабету — тобто приблизно 40 мільйонів людей по всьому світу — припадають на діабет 1-го типу. Як вже говорилося, діабет 1-го типу виникає тоді, коли підшлункова залоза виробляє недостатньо інсуліну. Це відбувається через загибель бета-клітин підшлункової залози. Причиною можуть бути стрес, вірусні інфекції та аутоімунні порушення (які виникають у тому випадку, коли імунна система починає сприймати свої власні клітини як ворога і просто знищує їх). Єдиний вихід для хворих на діабет 1-го типу — довічні ін’єкції інсуліну і дотримання спеціальної дієти (при діабеті 2-го типу достатньо просто дотримуватися дієти, тому що інсулін є, але його потрібно більше, щоб клітини на нього відреагували).

Якщо знижувати кількість вуглеводів у раціоні, залишається більше інсуліну для впливу на клітини. Для діабетиків розроблені спеціальні таблиці (рис. 2), завдяки яким вони підраховують необхідну кількість інсуліну для ін’єкцій. Дієтологами була запропонована одиниця виміру — хлібна одиниця, або ХЄ. Одна ХЕ — це приблизно 10-12 грам засвоєних вуглеводів; наприклад, один шматок білого хліба вагою 20 г — це одна хлібна одиниця. Зараз вже існують мобільні додатки, які полегшують підрахунок.

Рис, 2. Таблиця хлібних одиниць

Кількість інсуліну розраховується лікарем індивідуально, проте хворому важливо дотримуватися дієти: якщо він вжив вуглеводів більше або менше норми, то сам може скорегувати кількість інсуліну. Коли дозу інсуліну підраховано, необхідно зробити ін’єкцію. Укол робиться в шкірну складку, так щоб інсулін опинився в жировій клітковині (рис. 3), звідки він поступово переміститься в кров.

Рис, 3. Схема підшкірного введення інсуліну

Місця для ін’єкцій можуть бути різними: живіт, стегно, плече тощо. Однак, треба враховувати, що швидкість всмоктування інсуліну в різних місцях різна (рис. 4).

Рис, 4. Області для інсулінових ін’єкцій із зазначенням швидкості всмоктування

Але де взяти інсулін для ін’єкцій? На початку XX століття для цього використовувався коровий інсулін, який відрізняється від людського на кілька амінокислот, але тим не менш здатний знижувати рівень глюкози в крові. (Докладніше про це відкриття див.: Історія однієї молекули). З розвитком генної інженерії коровій інсулін був замінений людським, який синтезується кишковою паличкою або дріжджами. Якщо коротко, то ген людського інсуліну вставляють в ДНК E. coli або дріжджів. Методом селекції відбираються ті клітини, в які ген вдало вбудувався. Потім їх вирощують на живильному середовищі, вони розмножуються, спокійно і невибагливо крім своїх білків синтезують людський інсулін. Зрештою клітини руйнують, а отриману суміш очищають. Людський інсулін готовий! Такий спосіб отримання використовується і в наші дні. (докладніше про те, як переносять гени, див.: «Редактори геномів». Від «цинкових пальців» до CRISPR).

І хоча проблема з отриманням інсуліну для ін’єкцій була вирішена, така терапія не завжди буває вдалою: хворі можуть пропускати уколи через острах голок або больових відчуттів під час введення шприца, особливо якщо мова йде про дітей. Крім того, якщо неправильно розрахувати необхідну кількість інсуліну і ввести значно більше, може спостерігатися гіпоглікемія — стан, коли кількість глюкози в крові знижується до критичного (нижче 2,2-2,8 ммоль/л). У цьому стані у людини починається тремор, підвищується тиск, спостерігається загальна слабкість і порушення свідомості. Найгірший результат — кома і навіть смерть. Саме тому пошук альтернативного шляху доставки інсуліну є актуальною проблемою.

Виходом з положення було б вживання інсуліну перорально (через рот). Однак, шлунково-кишковий тракт є бар’єром для такої доставки: соляна кислота в шлунку денатурує білкові молекули, ферменти в кишечнику розщеплюють білки до амінокислот, а епітеліальні клітини, з яких складаються ворсинки тонкої кишки, всмоктують тільки невеликі молекули. Крім цього, ворсинки покриті шаром сер, що ускладнює всмоктування.

Дослідники з Гарвардського університету (США) і Каліфорнійського університету в Санта-Барбарі розробили на основі іонної рідини препарат для доставки інсуліну через шлунково-кишковий тракт, який зможе допомогти хворим на діабет 1-го типу.

Що таке іонна рідина і для чого вона потрібна?

Білкові молекули не особливо стабільні: їм потрібні певні умови, щоб вони не згорталися в неправильні форми. При порушенні умов зберігання білок може стати неактивним. І тут на допомогу приходить іонна рідина, яку останнім часом часто використовують як розчинник. Як можна здогадатися з назви, іонні рідини складаються з іонів: катіонів та аніонів. По суті, це солі в рідкому стані. Комплекс ліків з іонною рідиною робить його добре розчинним у воді і дозволяє йому залишатися в одній і тій же активній формі. Оскільки інсулін є білком, у своїй роботі вчені змішували інсулін в іонній рідині, що складається з холіну і геранієвої кислоти (див. Geranic acid), рис. 5 — ці інгредієнти, на думку Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів США (Food and Drug Administration), безпечні для людей. Цей склад вже встиг добре себе зарекомендувати: у попередніх дослідженнях цієї ж наукової групи було показано, що саме комплекс холін — геранієва кислота покращує проникнення ліків у шкіру майже в 5 разів (M. Zakrewsky et al., 2014. Ionic liquids as a class of materials for transdermal delivery and pathogen neutralization) Ворсинки кишечника, так само як і шкіра, складаються з епітеліальної тканини, тому було прийнято рішення розробити препарат для перорального прийому на основі іонної рідини.

Рис, 5. Ліворуч — геранієва кислота, C₁₀H₁₆O₂; праворуч — холін, C₅H₁₄NO. Зі статті: M. Zakrewsky et al., 2014. Utilization of Ionic Liquids for Pathogen Neutralization

Для подолання першої перешкоди — кислого середовища шлунка — препарат з інсуліну в іонній рідині був поміщений в капсулу з кислостійким покриттям (рис. 6), яке вже давно використовується у фармакології. Таке покриття розчиняється, коли капсула потрапляє в лужне середовище кишківника, в результаті чого іонна рідина та інсулін вивільняються.

Рис. 6. Капсули з інсуліном в іонній рідині для перорального прийому (для щурів). Місткість капсули — 0,025 мл, зовнішня довжина — 8,4 мм. Фото з додаткових матеріалів до обговорюваної статті в PNAS

Як вже говорилося раніше, наступна перешкода — ферменти в кишечнику, які розщеплюють білкові молекули. Виявилося, що іонна рідина захищає інсулін від дії ферментів, що дозволяє молекулі інсуліну залишатися в незмінному вигляді. Крім цього, комплекс холін — геранієва кислота здатний розріджувати слиз кишечника, тим самим полегшуючи всмоктування препарату.

Останній бар’єром є самі епітеліальні клітини кишечника. Справа в тому, що ці клітини виконують транспортну і бар’єрну функцію, тому вони здатні пропускати одні речовини і затримувати інші. Вибіркову проникність забезпечують мембрани клітин, в які вбудовані білки, що пропускають певні молекули. Наприклад, амінокислоти переносяться через білки-транспортери. У присутності іонів натрія амінокислота зв’язується з білком, той змінює свою форму і пропускає молекулу всередину. Для кожного виду молекул існують свої транспортні білки. Немає білка — немає транспорту. Для інсуліну в тонкому кишечнику немає таких білків, тому що в нормі він потрапляє з підшлункової залози відразу в кровотік. Однак, між клітинами є невеликі проміжки, через які здійснюється так званий парацелюлярний транспорт (див. Paracellular transport). Як правило, такий прохід відкритий для іонів і гідрофільних молекул, але не для таких великих молекул, як інсулін. Однак іонна рідина робить весь комплекс гідрофільним, тому молекула легко проходить і через цей бар’єр. Пройшовши через шар клітин, інсулін потрапляє в кров.

Як зазначають самі дослідники, їхній підхід подібний до швейцарського ножа, де в одного ліку є всі інструменти для усунення кожної з перешкод.

Ще одним явним плюсом цього препарат є те, що його виготовлення не вимагає багато вкладень, а ліки досить стабільно і може зберігатися при кімнатній температурі протягом двох місяців — це значно більше термінів зберігання інсуліну для ін’єкцій. Щоб перевірити, чи змінюється форма білка при тривалому знаходженні в іонній рідині, вчені зберігали зразки препарату при кімнатній температурі і при температурі 4 ° C. Протягом чотирьох місяців за допомогою методу спектроскопії кругового дихроїзму порівнювалися свіжоприготовлені зразки і ті, які зберігалися. Весь цей час структура інсуліну залишалася незмінною (рис. 7).

Рис, 7. Графік, побудований на основі результатів методу спектроскопії кругового дихроїзму. Добре видно, що інсулін залишався в одній і тій же альфа-спіральній конформації протягом усього періоду зберігання. По осі у — mdeg (міліградус повороту поляризованого світла), по осі х — довжина хвилі в нм. Зображення з обговорюваної статті в PNAS

Біологічну активність препарату перевіряли на самцях щурів: їм робили ін’єкції зі зразками з різним терміном зберігання, а потім перевіряли рівень глюкози в крові — він знижувався однаково. Також дослідники перевірили ефективність перорального прийому. Щурам давали готові капсули розміру 9 (місткістю 0,025 мл і довжиною 8,4 мм), а потім вимірювали рівень глюкози в їх крові. Через дві години після прийому капсули рівень глюкози знизився на 38%, а через 10 годин — на 45%.

Щоб упевнитися, що капсули з іонною рідиною біосумісні з тканинами тонкого кишечника, були приготовані гістологічні препарати. Щурів, які отримували капсули, розкрили, вилучили тонкий кишечник і приготували серію зрізів. Зрізи були пофарбовані гематоксиліном і еозином — класичними барвниками для гістологічних препаратів (див. забарвлення гематоксиліном і еозином). Змін у морфології кишківника не було, а ворсинки були виявлені на всіх зрізах.

На цьому плюси не закінчуються. Дослідники відзначають, що саме пероральна доставка, на відміну від ін’єкцій, імітує фізіологічний шлях інсуліну. В організмі інсулін з підшлункової залози переноситься через воротну вену в печінку, де приблизно 80% гормону утримується і частина, що тільки залишилася, потрапляє в кров. Інсулін, введений підшкірно, потрапляє в кров нерівномірно і з різною швидкістю залежно від місця уколу.

Спроби винайти препарат для доставки інсуліну через шлунково-кишковий тракт почалися багато десятиліть тому. Було розроблено кілька стратегій для подолання перешкод, проте до сьогоднішнього дня ще жоден з підходів не дозволив створити дешеві і не токсичні ліки, що справляються з усіма перешкодами. Наприклад, австрійські вчені запропонували комплекс, до складу якого входять білки, що зупиняють дію ферментів у кишечнику. (A. H. Krauland et al., 2004. Oral insulin delivery: the potential of thiolated chitosan-insulin tablets on non-diabetic rats). Однак інгібітори ферментів можуть викликати побічні ефекти, такі як інтоксикація і гіпертрофія підшлункової залози.

Японські вчені запропонували таблетку, покриту трьома оболонками, яка розчиняється тільки в товстому кишечнику, де ферменти, що руйнують білки до амінокислот, вже не такі активні. (M. Katsuma et al., 2006. Effects of absorption promoters on insulin absorption through colon-targeted delivery). Однак площа товстого кишечника менше, ніж тонкого, і в ньому менше води, тому він не так добре підходить для всмоктування лікарських препаратів.

Багато запропонованих ліків вимагають великих витрат на виробництво або мають складну рецептуру. Таким чином, розглянутий у даній статті препарат є найбільш кращим для масового виробництва: він ефективний, довго зберігається, легкий у приготуванні, безпечний і досить дешевий. Дослідники планують продовжувати роботу і сподіваються отримати схвалення на клінічні випробування за участю людей.

Джерело: Amrita Banerjee, Kelly Ibsen, Tyler Brown, Renwei Chen, Christian Agatemor, and Samir Mitragotri. Ionic liquids for oral insulin delivery // PNAS. June 25, 2018. https://doi.org/10.1073/pnas.1722338115.

Анастасія Пашутова