Молекулярно-біологічні способи дослідження та їх використання

Навчання 02 липня 2022 Перегляди: 87

Молекулярно-біологічні методи дослідження відіграють велику роль у сучасній медицині, криміналістиці та біології. Завдяки досягненням у галузі вивчення ДНК і РНК, людина здатна вивчити геном організму, визначити збудника захворювання, розпізнати потрібну нуклеїнову кислоту в суміші кислот тощо.

Молекулярно-біологічні методи дослідження. Що це таке?

Ще в 70-80-х роках вченим вперше вдалося розшифрувати геном людини. Ця подія дала поштовх розвитку генної інженерії та молекулярної біології. Вивчення властивостей ДНК і РНК призвело до того, що тепер можна використовувати ці нуклеїнові кислоти з метою діагностики захворювання, вивчення генів.

Отримання ДНК і РНК

Молекулярно-біологічні методи діагностики вимагають наявності вихідного матеріалу: частіше це нуклеїнові кислоти. Існує кілька способів виділення цих речовин з клітин живих організмів. Кожен з них має свої переваги і недоліки, і це треба враховувати при виборі методу виділення нуклеїнових кислот в чистому вигляді.

1. Отримання ДНК по Мармуру. Метод полягає в обробці суміші речовин спиртом, в результаті чого чиста ДНК випадає в осад. Мінусом цього способу є використання агресивних речовин: фенолу і хлороформу.

2. Виділення ДНК по Буму. Основна речовина, яка використовується тут, — це гуанідин тіоціонат (GuSCN). Воно сприяє облозі дезоксирибонуклеїнової кислоти на спеціалізованих субстратах, з яких у подальшому можна її зібрати за допомогою спеціального буфера. Однак GuSCN — це інгібітор ПТЦ, і навіть невелика його частина, що потрапила в обложену ДНК, може вплинути на хід полімеразної ланцюгової реакції, яка відіграє важливу роль при роботі з нуклеїновими кислотами.

3. Облога домішок. Метод відрізняється від попередніх тим, що осаджуються не самі молекули дехоксирибонуклеїнової кислоти, а домішки. Щоб це здійснити, використовують іонообмінники. Брак у тому, що не всі речовини можуть осадитися.

4. Масовий скринінг. Використовується цей спосіб у тих випадках, коли не потрібні точні відомості про склад молекули ДНК, а необхідно отримати якісь статистичні дані. Пояснюється це тим, що структура нуклеїнової кислоти може пошкодитися при обробці детергентами, зокрема, лужами.

Класифікація методів дослідження

Всі молекулярно-біологічні методи дослідження поділяються на три великі групи:

1. Ампліфікаційні (з використанням безлічі ферментів). Сюди належить ПЛР — полімеразна ланцюгова реакція, яка відіграє велику роль у багатьох з методів діагностики.

2. Неампліфікаційні. Ця група методів пов’язана безпосередньо з роботою сумішей нуклеїнових кислот. Прикладами є 3 види блоттингів, in situ гібридизація тощо.

3. Методи, засновані на розпізнаванні сигналу від молекули зонда, який пов’язується з певною ДНК або РНК зонда. Приклад — система гібридизації в розчині Hybride Capture System (hc2).

Ферменти, які можуть використовуватися в молекулярно-біологічних методах дослідження

Багато методів молекулярної діагностики передбачають використання великого діапазону ферментів. Нижче представлені найбільш часто:

1. Рестриктаза — «ріже» молекулу ДНК на необхідні частини.

2. ДНК-полімераза — синтезує двозчіпкову молекулу дезоксирибонуклеїнової кислоти.

3. Зворотна транскриптаза (ревертаза) — використовується для синтезу ДНК на матриці РНК.

4. ДНК-лігазу — відповідає за утворення фосфодіефірних зв’язків між нуклеотидами.

5. Екзонуклеаза — видаляє нуклеотиди з кінцевих ділянок молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти.

ПЛР — основний спосіб ампліфікації ДНК

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) активно використовується в сучасній молекулярній біології. Це метод, за якого з однієї молекули ДНК можна отримати величезну кількість копій (ампліфікувати молекули).

Основні функції ПЛР:

— діагностика захворювань;

— клонування ділянок ДНК, генів.

Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідні такі елементи: вихідна молекула ДНК, термостабільна ДНК-полімераза (Taq або Pfu), дезоксирибонуклеотид-фосфати (джерела азотистих підстав), праймери (2 праймери на 1 молекулу ДНК) і сама буферна система, в якій можливе проведення всіх реакцій.

ПЛР складається з трьох етапів: денатурація, випалювання праймерів і елонгація.

1. Денатурація. При температурі 94-95 градусів за Цельсієм проходить розрив водневих зв’язків між двома ланцюгами ДНК, і в підсумку ми отримуємо дві одноланцюжкові молекули.

2. Віджиг праймерів. При температурі 50-60 градусів за Цельсієм відбувається приєднання праймерів на кінцях одноланцюжкових молекул нуклеїнової кислоти за типом компліментарності.

3. Елонгація. При температурі 72 градусів відбувається синтез дочірніх двозчіпкових молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти.

Секвенування ДНК

Молекулярно-біологічні методи дослідження часто потребують знання послідовності нуклеотидів у молекулі дезоксирибонуклеїнової кислоти. Для визначення генетичного коду проводиться секвенування. Молекулярна діагностика майбутнього буде заснована на знаннях, отриманих при визначенні послідовності людини.

Виділяють такі види секвенування:

• секвенування за Максамом-Гілбертом;
• секвенування по Сенгеру;
• піросеквенування;
• нанопорове секвенування.