Оптогенетика: найсвітліші думки

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 67

Мозок складається з мільярдів клітин — нейронів, організованих у складні мережі. Стежити за роботою окремих груп нейронів важко, ще складніше ними керувати. Однак близько десяти років тому у дослідників з’явився унікальний інструмент для вивчення нервових клітин. Тепер вмикати або вимикати нейрони можна, просто направивши на них промінь світла, причому прямо в мозку. Метод, що «висвітлив» в останні роки вивчення мозку, називають оптогенетикою.

В очікуванні нового методу

Роботу будь-якої системи зручно вивчати, по черзі вимикаючи окремі її частини. Таким чином можна виявити ті з них, що важливі для роботи всієї системи. Визначивши ключові елементи системи, корисно навчитися ними маніпулювати, тоді ми зможемо керувати процесом на свій розсуд і вивчати його в деталях. Однак коли мова йде про дослідження нервової системи, застосування такого підходу стикається з серйозними труднощами.

У мозку людини знаходиться близько 80 мільярдів нейронів, що утворюють складні розгалужені мережі. Вважається, що кожна окрема нейронна мережа може визначати якусь елементарну функцію. Взаємодія цих мереж у різних зонах мозку забезпечує складну нервову діяльність. Довгі роки про функції структур мозку судили з порушень, які з’являлися при пошкодженні його ділянок, або з того, які зони мозку активні при виконанні випробовуваним різних завдань.

Миша з вбудованим в мозок оптоволокном для доставки світла. Фото з сайту bioeng.psu.edu (Університет штату Пенсільванія, США)

Цікаві результати були отримані в експериментах на тваринах, в мозок яких вживляли електроди, щоб штучно збуджувати ті чи інші ділянки мозку. На тваринах проводили і дослідження з використанням хімічних речовин, здатних вибірково гальмувати роботу нейронів певного типу. Однак кожен з цих методів має суттєві недоліки: або дія одночасно на велику кількість нейронів, або низький тимчасовий дозвіл. Навіть найменший вживлений у мозок електрод невибірково збуджує всі навколишні його нервові клітини, а найсучасніший хімічний інгібітор діє набагато довше, ніж природні стимули.

Інструментарій

Ідею керувати нейронами «точково» вперше чітко висловив у 1979 році Френсіс Крік (який отримав Нобелівську премію за відкриття структури ДНК). Через двадцять років, в 1999-му, він запропонував використовувати для збудження нейронів світло. Світлове випромінювання має багато переваг: воно швидко досягає об’єкта, його легко дозувати і представляти у вигляді коротких імпульсів. У 2005 році група дослідників зі Стенфордського університету під керівництвом Карла ^ ерота зуміла викликати збудження нервових клітин, опромінюючи їх світлом. Для цього нейрони довелося піддати генно-інженерним маніпуляціям. Новий метод отримав назву оптогенетики і за останні роки справив справжню революцію в дослідженнях нервової системи.

Щоб нейрон став світлочутливим, він повинен мати білок — рецептор світла. Приклад нейронів, чутливих до світла «від природи», — клітини сітківки ока. Вони містять рецептор родопсин, який складається з білка, званого опсином, і кофактора ретиналю — похідного вітаміну А. Під дією світла ретиналь змінює свою структуру, і ці зміни передаються на білок, який активує сигнальні шляхи нейрона, що викликають його збудження. У спокої нейрон заряджений негативно: всередині клітини концентрація натрію та інших позитивних іонів мала. При збудженні включаються іонні канали в зовнішній мембрані нейрона, що закачують позитивний натрій всередину. Заряд всередині клітини стає позитивним. У такому стані нейрон збуджений і готовий передати сигнал іншим нейронам в мережі.

Стан спокою і збудження нейрона визначаються різницею в концентрації позитивних іонів K + і N^a + всередині клітини і за її межами. У стані спокою позитивні іони K + ефективно виводяться з нейрона за рахунок дифузії (А). Через це клітина набуває негативного заряду. У нейронах є натрієві канали, здатні активно закачувати позитивні іони Na + всередину клітини. У стані спокою вони закриті. Однак при збудженні клітини ці канали відкриваються, відбувається інтенсивне надходження позитивних ^іонів Na + всередину і клітина стає позитивно зарядженою (Б). У такому стані нейрон є збуджений і готовий передати свій стан іншим нейронам мережі. У них у відповідь відбудеться аналогічна зміна заряду. Досить швидко придбаний позитивний заряд втрачається, і клітини готові провести черговий нервовий імпульс. Всі ці події відбуваються протягом тисячних часток секунди. Ілюстрація: Lodish Harvey, Berk Arnold, Matsudaira Paul et al. Molecular Cell Biology, 5ed., 2004

Перші спроби створити нейрони, керовані світлом, полягали в перенесенні в них опсинових генів ссавців. Читання нового гена в таких нейронах призводить до синтезу світлочутливого білка. Ці роботи, що проводилися на початку 2000-х, мали дуже обмежений успіх. Під дією світла штучні нейрони з родопсином активувалися повільно і нестабільно. Сигнальні системи нейронів не призначені для взаємодії з родопсином. Здавалося, оптогенетика, ледь виникнувши, зайшла в глухий кут. Рішення прийшло несподівано.

За допомогою оптогенетики дослідники можуть керувати нейронами, використовуючи світло. Малюнок зі статті Lizzie Buchen//Nature, vol. 465, 6 may 2010

Не тільки тваринам потрібно відчувати світло. Світлочутливими рецепторами володіють, наприклад, одноклітинні водорості. Їхній «зір» також заснований на роботі родопсинів. Чудова властивість цих білків полягає в тому, що вони не тільки сприймають світло, а й самі відіграють роль іонних каналів і викликають збудження клітини. Тому їх прийнято називати канальними родопсинами. Виявилося, що ці білки працюють набагато стабільніше родопсинів ссавців. Нейрони, що несуть їх на своїй поверхні, дають швидку і чітку відповідь на світлове випромінювання. Перший канальний родопсин відкрили американці Д. Остерхельт і В. Стокеніус 1971 року, але минуло понад 30 років, перш ніж родопсини мікроорганізмів і нейрони ссавців «зустрілися». Під час досліджень родопсинів мікробів відкрили цілий ряд світлочутливих білків з різними властивостями. Одні з них проводять іони натрію, інші — відразу кілька типів позитивних іонів. Є родопсини, навпаки, виводять позитивні іони з клітин. Вони здатні знімати збудження. Таким чином, можна не тільки цілеспрямовано активувати, а й вимикати нейрони. Особливої уваги заслуговують родопсини, які сприймають світло з різною довжиною хвилі. Це дозволяє одночасно і незалежно керувати різними групами нейронів за допомогою, наприклад, синього і червоного світла.

У 2002 році біологи з Франкфурта описали новий родопсин одноклітинної зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii. Цей білок став першим канальним родопсином, використаним для управління нейронами. Спочатку обнадійливі результати були отримані на культурах клітин. Наступний крок — управління нейронами в мозку живого організму — став можливий завдяки розвитку генно-інженерних методів. У 2005 році, незабаром після експериментів з культурами клітин, група під керівництвом Хірому Яво з Університету Тохоку в Японії провела експеримент з мозком живої миші.

Існують два способи доставити ген родопсина в клітини мозку. Перший передбачає отримання трансгенного організму. Так, наприклад, ген родопсина може бути вбудований в геном миші на стадії ембріонального розвитку, і тоді всі клітини тіла будуть його містити. Але працювати цей ген стане не у всіх клітинах, а лише там, де він буде активований. Активністю гена можна керувати. Зазвичай для цього в послідовності ДНК перед геном розміщують «управляючу» ділянку. Щоб ген активувався, ця ділянка повинна бути прочитана білками клітини. Існують послідовності, які можуть бути прочитані тільки в клітинах певного типу. Сучасній генетиці відомі сотні таких сигналів для різних клітин і тканин, у тому числі і для різних типів нейронів. Є ряд чудових модифікацій цього підходу, що дозволяють використовувати бібліотеки трансгенних тварин (створені в інших дослідженнях) для націлювання родопсинів у різні клітини нервової системи. Однак отримання трансгенної миші вимагає декількох місяців.

Другий спосіб доставки гена в клітини працює набагато швидше. У ньому використовуються віруси, що несуть ген родопсина. У разі введення в мозок досить великої кількості вірусу, що проникає в нейрони, напрацювання світлочутливих білків відбувається дуже ефективно. Генно-інженерні віруси, які використовуються для цих цілей, сильно змінені і не здатні розмножуватися. Вони ефективно проникають в клітини і напрацьовують в них родопсин, в іншому для організму експериментальної тварини вони нешкідливі.

Окреме завдання — доставка світла до нейронів, розташованих в глибині мозку. У більшості випадків для цього використовуються оптоволоконні світководи. Джерелом світла може служити лазер або світлодіод. Конструкція пристроїв дозволяє гризуну вільно переміщатися в клітці, незважаючи на постійно підключений до голови кабель. З недавньою розробкою родопсина, активованого червоним світлом, завдання освітлення мозку спростилося. Червоне світло добре проникає в тканини і в ряді завдань при його використанні вдасться відійти від впровадження в мозок оптоволокна.

Штучні спогади

Завдяки оптогенетиці безліч питань, що стосуються роботи мозку, отримали шанс на вирішення. Так, наприклад, високоточна прицільна активація або високоточне прицільне вимикання зон мозку дозволили картувати області, відповідальні за довготривалу і короткочасну пам’ять. Крім того, з’явилася можливість підійти до вивчення пам’яті з нового боку.

Наше сприйняття навколишнього представлено в мозку поєднанням активних і бездіяльних нейронів. Спогад — це відтворення тієї комбінації збуджених нейронів, яка колись виникла. В одній з недавніх робіт, виконаних в Массачусетському технологічному інституті під керівництвом нобелівського лауреата Судзумі Тонегави, у мишей за допомогою світла викликали спогади і надавали їм новий сенс. Це дослідження базується на класичному підході до вивчення пам’яті з використанням миші як модельного об’єкта. У центрі уваги знаходиться реакція страху на електричний шок, що виникає в кімнаті, де тварина колись його відчувала.

Уявімо собі мишу в кімнаті А, тут вона поводиться зазвичай. Перенесемо гризуна в кімнату Б з іншим оточенням і піддамо слабкому електричному шоку. Тепер при кожному перенесенні в кімнату Б миша буде відчувати страх навіть без шоку. Оцінити страх в даному випадку досить просто: зазвичай дуже рухливий гризун групується і завмирає. Спогад про кімнату Б асоціюється у тварини з больовим відчуттям. Нейробіологам вдалося зробити світлочутливими тільки ті нейрони, які активувалися під час перебування миші в кімнаті А. Комбінація світлочутливих нейронів в даному випадку — записаний спогад про цю кімнату. Далі експериментатори викликали цей спогад за допомогою світла під час електричного шоку в кімнаті Б. Чи стала миша після цього боятися удару в кімнаті А, де ніколи раніше його не відчувала? Правильна відповідь: Так.

Краса цієї роботи заснована на більш ранніх дослідженнях мозку, які виявили в ньому ділянку, пов’язану зі спогадами. Це гіпокамп. Саме з його нейронами проводилися маніпуляції в згаданому експерименті.

Повернення до сітківки

Отже, родопсини мікробів визнали вдалим інструментом для створення світлочутливих клітин. Але чи можна застосувати мікробні родопсини для лікування сліпоти? Існує спадкове захворювання — пігментний ретиніт, пов’язане з дегенерацією клітин сітківки ока. Воно викликає прогресуючу втрату зору. Ефективного лікування для пігментного ретиніту сьогодні не існує. Значна частина випадків цієї хвороби пов’язана з порушеннями в гені, що кодує родопсин. Цей ген важливий для роботи двох типів клітин-рецепторів у складі сітківки. Це палички, які мають хорошу світлочутливість, але не здатні забезпечувати кольоровий зір, і колбочки, що дозволяють розрізняти колір, але менш чутливі до інтенсивності світла. У хворих пігментним ретинитом клітини палички досить швидко гинуть, проте колбочки, втративши здатність сприймати світло, живуть ще довгий час. Чи є можливість замінити в решті клітин непрацюючий родопсин на світлочутливий білок з бактерій? Група дослідників зі Швейцарії під керівництвом Ботонда Роска для відповіді на це питання використовувала канальний родопсин архебактерій.

Nature 463:98. Лабораторія синтетичної нейробіології, Массачусетський технологічний інститут, США’) «» >

Нейрон, підготовлений для управління світлом. Світлочутливі іонні канали клітини містять ділянку, що флуоресціює зеленим світлом. Фото зі статті Han B. Y., Dobry X., Qian A. S. та ін. (2010) High-performance genetically targetable optical neural silencing by light- driven proton pumps, Nature 463:98. Лабораторія синтетичної нейробіології, Массачусетський технологічний інститут, США

Існує мишача пігментного ретиніту. Якщо за допомогою вірусів внести мікробний родопсин в колбочки сітківки, у гризунів спостерігається часткове відновлення зору. У стандартних тестах такі миші демонстрували поліпшення орієнтації в просторі в порівнянні з хворими гризунами без терапії. Цікаво, що використаний у роботі мікробний білок, званий eNpHR 3.0 (вдосконалений галородопсин з Natronomonas pharaonis версії 3.0), — вже третя версія модифікованої вихідної молекули. Методами генетичної інженерії постійно ведеться удосконалення мікробних родопсинів для поліпшення їх роботи в клітинах ссавців.

Перенесення такого методу лікування на людину — непростий крок, оскільки в ньому використовуються віруси. Потрібно багато додаткових контрольних експериментів, щоб показати повну нешкідливість цієї технології для людей. Проте автори показали ефективність роботи білка eNpHR 3.0 в ізольованих клітинах сітківки ока людини. Подібні роботи — серйозне просування до терапії хвороб, пов’язаних з втратою активності нейронів. Наприклад, якщо клітини, які постраждали при нейродегенеративному захворюванні, зробити світлочутливими, їх роботу можна знову запустити, опромінюючи світлом.

Не тільки нейрони

Можливість керувати майже будь-якими групами нейронів у мозку породила нові експериментальні роботи, багато з яких стали справжнім проривом у своїй області. Але сьогодні додаток оптогенетики — це не тільки нейрони. Строго кажучи, до оптогенетики можна віднести будь-який метод, що передбачає активацію будь-якого процесу світлом, якщо можливість такої активації забезпечена методами генної інженерії.

На даний момент створені системи, в яких світло може керувати активністю гена, вимикати роботу білків або запускати клітинну загибель. Примітно, що в таких дослідженнях використовуються не тільки білки, що діють як іонні канали. Так, наприклад, отримано білок, названий KillerRed (червоний кілер), що виробляє при опроміненні світлом активні форми кисню. Активний кисень здатний руйнувати будь-які органічні молекули. Опромінення червоним світлом клітини з досить великою кількістю білка KillerRed викличе її загибель. Втім, подібний метод можна використовувати не тільки для вбивства цілої клітини. За допомогою генетичних методів ділянку, що генерує активні форми кисню в невеликих кількостях, можна включити в будь-який клітинний білок. Тоді світло викличе інактивацію всіх таких білків у клітці, що дозволить судити про їх функції. Перспективною також може виявитися цілеспрямована доставка світлочутливих молекул у клітини ракових пухлин для їх знищення.

Ідея управління клітинами за допомогою світла народилася задовго до появи оптогенетики. Однак для її реалізації потрібен розвиток низки галузей науки, особливо генної інженерії. Цікаво спостерігати, як з незв’язаних робіт з вивчення світлочутливих білків мікробів і мозку ссавців виник метод, визнаний науковою спільнотою революційним. Об’єднавши кілька наукових областей, оптогенетика сьогодні сама стала двигуном технологій, що розробляються під її запити.