Полімерні наночастинки — нова зброя в боротьбі з бактеріями?

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 65

Ріс 1. Синтезовані під час дослідження сферичні (a) і стрижнеподібні (b) полімерні молекулярні щітки імітують два основні мотиви структури бактеріофагу. Їх хімічну будову наведено на схемах c і d. Сині ланцюжки на зображеннях a і b і сині фрагменти структурних формул на схемах c і d відповідає полі (4-вініл-N-метилпірідінійодиду); червоні елементи і фрагменти структурних формул відповідають лід-циклодекстрину (для a і c) і полі [2- (бромізобутіл) етилметакрилату] (для b і d). Малюнок з обговорюваної статті в ACS Infectious Diseases

Полімерні наночастинки, що імітують будову оболонки вірусів, можуть селективно вбивати різні типи бактерій (включаючи штами, що виробили резистентність до антибіотиків), не впливаючи на клітини людини. Варіювання розмірів та форми наночастинок змінює їх специфічну активність. Результати дослідження можуть стати основою для нової стратегії розробки протимікробних препаратів, які будуть боротися з інфекціями, не сприяючи розвитку у бактерій резистентності.

Стійкість організмів до дії антибіотиків — антибіотикорезистентність — в даний час є однією з найбільш серйозних проблем охорони здоров’я. У доповіді Всесвітньої організації охорони здоров’я, опублікованій у квітні 2014 року, сказано таке: «Резистентність вже не являє собою лише прогноз на майбутнє, оскільки вона вже проявляється прямо зараз в кожному регіоні світу і може негативно позначитися на кожному, незалежно від віку, в кожній країні. Стійкість до антибіотиків — явище, коли бактерії змінюються настільки, що антибіотики більше не впливають на організм людей, які потребують їх для боротьби з інфекцією, і це зараз одна з найсерйозніших загроз для здоров’я людей «(докладніше про те, чим небезпечна стійкість бактерій до антибіотиків, можна прочитати в статті Антибіотиковий апокаліпсис). Звичайно, прогрес в області створення нових антибіотиків теж не стоїть на місці, регулярно повідомляється про створення препаратів, стійкість до яких у бактерій виробляється дуже повільно (див., наприклад, новина Синтезований суперантибіотик, до якого не виробляється резистентність, «Елементи», 06.06.2017), проте стратегії, що застосовуються для розробки протимікробних препаратів, на жаль, не блищать різноманітністю. До них належать блокування механізмів, що керують будівництвом клітинної мембрани бактерії, порушення роботи бактеріальної рибосоми, що відповідає за процеси білкового синтезу, або порушення реплікації бактеріальних ДНК. На жаль, яким би потужним не був новий антибіотик, рано чи пізно природний відбір призводить до того, що з’являються штами бактерій, стійкі і до його впливу. До механізмів захисту, які виробляються у бактерій, можуть відноситися біохімічна модифікація антибіотика, що знижує його активність, зміна бактерією молекулярної мішені, на яку впливав антибіотик, або активне виведення лікарського препарату з клітини бактерії.

Вирішуючи завдання розробки нових протимікробних препаратів, дослідники намагаються винаходити нові типи стратегій — отримувати системи, здатні в прямому сенсі розривати на частини бактеріальні клітини, не даючи їм часу на вироблення резистентності. Один з таких перспективних підходів — застосування антимікробних пептидів (antimicrobial peptides). Це короткі ланцюжки, що складаються з амінокислотних залишків, виробляються різними організмами для захисту від біологічних патогенів (бактерій, паразитів або грибків). Дія антимікробних пептидів заснована на їх вбудовуванні в клітинну мембрану патогенного організму, порушенні структурної цілісності мембрани і, як наслідок, руйнуванні клітини.

Раніше були отримані протимікробні наночастинки з антимікробних пептидів природного походження (див., наприклад, G. N. Tew et al., 2010. De novo design of antimicrobial polymers, foldamers, and small molecules: From discovery to practical applications), а також з полімерів, що моделюють ці пептиди (E. F. Palermo, K. Kuroda, 2010. Structural determinants of antimicrobial activity in polymers which mimic host defense peptides). Однак наночастинки і з білків, і з імітуючих їх будову синтетичних полімерів мають загальний недолік: їх гідрофобні фрагменти руйнують також і оболонки клітин ссавців. Це обмежує можливість застосування таких систем як антибіотиків.

Дослідники з групи Хунцзюня Ляна (Hongjun Liang) з Техаського технологічного університету припустили, що велику вибірковість у боротьбі з бактеріями можуть продемонструвати білки бактеріофагів — вірусів, які не мають гідрофобних фрагментів і вибірково вражають бактеріальні клітини. Точніше, не самі білки бактеріофагів, а їх синтетична модель.

Дослідники отримали три наночастинки, що імітують будову бактеріофагів: сферу діаметром 8 нанометрів і два стрижня діаметром 7 нанометрів і довжиною один 18, інший — 70 нанометрів. Для синтезу полімерних наноструктур на першому етапі використовувалася блок-сополімерізація: до лід-циклодекстрину (ця структура слугувала основою для наночастинок сферичної форми) або полі [2- (бромізобутірив) етилметакрилату] (цей полімер був основою для стрижневидних наночастинок) прищеплювали нитки полі (4-вініл-N-метилпірідіну). Отримані блок-сополімери, що містять в обрамлюючих групах пиридинові фрагменти, на другому етапі отримання наночастинок піддали модифікації, обробивши йодметаном. Відбулася реакція кватернізації (у цій реакції незаряджений трьохвалентний атом азоту (рідше фосфору) реагує з чим-небудь (найчастіше з кислотою або алкілгалогенідом), перетворюючись на чотирьохвалентний азот, несучий позитивний заряд, який врівноважується негативним зарядом кислотного залишку або галогенід-іона зі складу алкілгалогеніда; див. Quaternary ammonium cation), яка дозволила перетворити метилпірідінові фрагменти на сольові метилпірідінійодидні групи.

Вибір форм і розмірів наночастинок був продиктований бажанням змоделювати структурні мотиви деяких елементів бактеріофагів; так, наприклад, хвостова трубка бактеріофагу T4 характеризується довжиною 94 нм і діаметром 9,6 нм. Наночастинки складаються з полімерного ядра, обрамленого «ворсинками» з несучого позитивний заряд гідрофільного полімеру — полі (4-вініл-N-метилпірідінійодида) (рис. 1). Гідрофільність (тобто здатність утворювати міцні міжмолекулярні взаємодії з водою) фрагментів полімеру, що оточують ядро, досягається завдяки наявності іонного хімічного зв’язку між катіоном пиридинія (піридиний — іонне похідний пиридина) і йодид-аніоном у складі структурних ланок зовнішньої оболонки отриманих полімерних частинок. Вода — полярний розчинник, який за допомогою нехімічних зв’язків утворює міцні асоціати із зарядженими фрагментами полімеру.

Всі три типи наночастинок були випробувані на активність по відношенню до грамотрицьких штамів Escherichia coli (рис. 2), грамполоджувальних штамів Staphylococcus aureus, що проявляє стійкість до цілого ряду антибіотиків штаму Pseudomonas aeruginosa, а також на цитотоксичність щодо червоних кров’яних клітин людини. Експерименти показали, що найбільш ефективно працюють сферичні наночастинки. Щоб вбити 99,9% грамотрицької E. coli, потрібно не більше 32 мкг/мл наночастинок такого типу, а їх концентрація, смертельна для грамположительного S. aureus, становить 4 мгк/мл. Нарешті, для знищення 99,9% клітин стійкої до широкого набору антибіотиків P. aeruginosa достатньо концентрації лише 2 мкг/мл.

Ріс. 2. Отримані за допомогою скануючого електронного мікроскопа зображення бактерій E. coli. c — контрольний зразок, d—f — зразки, інкубовані з наночастинками: довгим стрижнем (d), коротким стрижнем (e) і сферою (f). Порушення цілісності оболонки бактерій проявляється вже через 200 секунд після початку інкубації E. coli зі сферичними наночастинками і з наночастинками, що представляють собою короткий стрижень. Малюнок з обговорюваної статті в ACS Infectious Diseases

Стержнеподібні частинки проявляли меншу протимікробну активність. Для наностержня з довжиною 70 нм мінімальна бактерицидна концентрація по відношенню до двох різних грамположительным штаммам S. aureus була не менше 512 мкг/мл. Це дуже висока концентрація, яка фактично виключає використання наночастинок цього типу як бактерицидів у боротьбі з грамполоджувальними мікробами: у такій концентрації наночастинки занадто шкідливі для організму (в першу чергу, для його фільтруючих органів, таких як печінка і нирки) і дороги для масового застосування. Зате наностержні небезпечні для грамотрицьких бактерій: мінімальна бактерицидна концентрація для грамотрицької P. aeruginosa становить 2 і 4 мкг/мл для наностержней з довжиною 18 і 70 нм відповідно.

Вибірковість по відношенню до грамотрицьких бактерій пов’язана з тим, що грамположні бактерії володіють щільною пептидогликаною оболонкою, пори якої з діаметром від 5 до 50 нм малопроникні або непроникні для стрижнеподібних наночастинок; разом з тим ті ж наностержні цілком здатні пошкодити тонку зовнішню ліпідну оболонку грамотрицьких бактерій. Передбачається, що отримані результати можуть виявитися корисними для управління активністю і селективністю бактерицидної наночастинки за рахунок зміни її розмірів або/і форми.

Проведені експерименти також показали, що всі три наночастинки безпечні для еритроцитів людини, вони не викликають ні руйнування їх мембрани, ні їх агглютинацію (злипання). Різне ставлення до клітин різних типів пояснюється різницею в будові мембран цих клітин. Оболонка еритроцитів людини, що складається переважно з неполярних і гідрофобних фосфоліпідів, не повинна взаємодіяти з полярними наночастинками, отже вони не зможуть вбудуватися в оболонку і порушити її цілісність або зв’язатися з оболонкою відразу двох і більше еритроцитів і викликати їх зліпання. До складу клітинних мембран бактеріальних клітин входять сфінголіпіди, в них у помітній кількості присутні полярні фрагменти — фосфохоліновий (див. Phosphocholine) або фосфоетаноламіновий (див. Phosphorylethanolamine), з якими і зв’язуються гідрофільні полімери, що утворюють оболонку наносфер або наностержнів.

Поки ще передчасно говорити про клінічне застосування бактерицидних наночастинок, проте дослідники сподіваються, що результати їх роботи дозволять на глобальному рівні змінити підходи до боротьби з патогенними мікроорганізмами. Їх робота може стати основою для створення нового класу антибіотиків — «наноантибіотиків», спрямований дизайн будови яких зробить можливим управління активністю, селективністю та біологічною сумісністю наночастинок, що проявляють бактерицидні властивості.

Джерело: Yunjiang Jiang, Wan Zheng, Liangju Kuang, Hairong Ma, Hongjun Liang. Hydrophilic Phage-Mimicking Membrane Active Antimicrobials Reveal Nanostructure-Dependent Activity and Selectivity Selectivity // ACS Infectious Diseases. 2017. DOI: 10.1021/acsinfecdis.7b00076.

Аркадій Курамшин