Поліпшена версія атомно-силового мікроскопа розповіла багато нового про білок титин

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 60

Ріс. 1. Схематичне зображення молекулярного пристрою поперечно-смугастого м’яза. У цьому впорядкованому розмаїтті молекул присутній і білок титин (темно-сині ниточки), який утримує всю цю конструкцію разом і перешкоджає зайвому розтягненню м’язового волокна. Зображення зі статті John C. Sparrow & Frieder Schöck. 2009. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way

Біофізики давно вивчають механічні властивості білка титину, що відіграє важливу роль у роботі м‘язових волокон. Однак досі експериментальні дані і результати молекулярного моделювання не вдавалося порівняти безпосередньо, оскільки вони відповідали абсолютно різним умовам. Група дослідників з Марселя і Барселони реалізувала нову експериментальну методику, яка перекинула місток через цю прірву і вперше дозволила порівняти ці два методи дослідження. Отримані результати поліпшили розуміння як самого білка, так і теоретичних моделей.

Тітін

У роботі м’язових волокон бере участь безліч білкових молекул (рис. 1), і кожна з них відіграє свою важливу роль (див. короткий огляд в недавній новині «Поворот і замок»: нова модель м’язового скорочення, «Елементи», 05.04.2013). У зв’язку з важливістю і складністю цього процесу дослідники прагнуть розібратися у всіх його нюансах, вивчити властивості і будову кожної молекули. Одна з них — це білок титин. У м’язовому волокні він відіграє роль біологічної «пружини», яка з’єднує його рухомі частини разом і утримує волокно від надмірного розтягнення. Хоч титин і не грає роль головного «мотора» в скороченні м’яза, він, тим не менш, дуже важливий, оскільки забезпечує її еластичність і повернення у вихідний стан при розслабленні. «Поломки» цієї молекули або кодуючого її гена можуть бути причиною серйозних патологій, зокрема кардіоміопатії. З цієї причини біологам потрібно у всіх деталях розуміти механіку цієї молекули, причому не тільки in vivo, але й ізольованої молекули самої по собі. Таким чином, титин стає об’єктом вивчення для атомної фізики, як теоретичної, так і експериментальної.

Назвавши титин біологічною «пружиною», потрібно тут же зробити важливе уточнення. Незважаючи на те що ця молекула грає роль пружини, поводиться вона зовсім не так, як ми б очікували від звичайної металевої пружинки. Звичайна пружина має жорстко задану конструкцію, всі її частини нерухомі, вони не живуть своїм життям і не смикаються туди-сюди. Молекула титину, як і всяка білкова молекула при нормальній температурі, зовсім не нерухома, а постійно коливається: то там, то тут трохи розпаковується і знову упаковується, — загалом, вона промацує доступний їй простір конфігураційних станів (рис. 2). Таке «занепокоєння» — невід’ємна частина існування білкової молекули, без цього вона б ніколи толком і не запакувалася. Але це означає, що для розтягнення молекули потрібно долати не тільки внутрішню механічну пругу, як у звичайної пружини, але і ось це «бажання постійно змінюватися». У статистичній фізиці це все записується у вигляді додаткової ентропійної сили, яка діє поряд з силами механічної пружності; тому титин справедливіше називати «ентропійною пружиною».

Ріс. 2. На відміну від звичайної механічної пружини, в «ентропійній пружині», якою є титин, з’являється додаткова ентропійна сила пружності, пов’язана з постійним «дослідженням» цією молекулою різноманітних конфігурацій

Головне питання в дослідженні механіки титину — як саме ця молекула розтягується під навантаженням і як вона згортається, коли навантаження зникає. Дослідникам потрібно розуміти цю механіку в найдрібніших деталях. Як залежить подовження молекули від докладеної сили? Які ділянки молекули розплітаються і на якому етапі? Які саме зв’язки між якими амінокислотами рвуться при якому навантаженні? Все це можна вивчати експериментально, буквально взявши молекулу за два кінці і розтягуючи її, можна теоретично, а можна і чисто обчислювально, за допомогою моделювання методами молекулярної динаміки. До речі, варто нагадати, що саме за молекулярне моделювання біологічних важливих комплексів була присуджена Нобелівська премія з хімії за 2013 рік.

Зрозуміло, при цьому потрібно переконатися, що все один з одним сходиться: результати моделювання узгоджуються з експериментальними даними, а теоретичні моделі правильно схоплюють всі знайдені залежності. І ось тут, виявляється, є одна велика проблема — досі не вдавалося безпосередньо порівняти експериментальні дані по титину з результатами моделювання. Швидкості розтягнення молекули, доступні цим двом методам, розрізнялися на порядки: в експерименті молекули розтягувалися занадто повільно, а обчислювальні ресурси просто не дозволяли змоделювати поведінку молекули так надовго. Хоча експеримент і моделювання призводили до різних результатів, було неясно, чи є ця розбіжність серйозною або ж просто відповідає двом різним режимам розтягнення.

В останньому випуску журналу Science була опублікована стаття, яка єдиним махом усуває цю прірву. У ній описується вдосконалена методика, яка дозволяє різко збільшити швидкість розтягнення молекули в експерименті і вперше порівняти результати вимірювань параметрів титину з моделюванням. Крім того, вона дозволила побачити тонкі деталі цього процесу і, між іншим, розкрила неточність деяких теоретичних оцінок.

Структура і дослідження титину

Умовно кажучи, титин являє собою такі собі молекулярні «буси». У ньому є кілька сот міцних компактних модулів імуноглобулінового типу (Ig-домени), а також спеціальна ділянка, що легко розплітається. Ця структура надає молекулі «м’яку» пружність при невеликих впливах, «жорстку» — при помірно великих, але одночасно з цим вона оберігає молекулу від розриву в критичних ситуаціях.

При звичайних фізіологічних навантаженнях кінці молекули розтягуються з силою в кілька піконьютонів (пН). При цьому Ig-домени міцно тримають свою форму, а розтягується саме м’яка ділянка, що дозволяє подовжити молекулу до деякої межі. За цією межею молекула все одно не рветься і може розтягуватися далі, але режим упругості тут змінюється. При посиленні навантаження вона спочатку тягнеться неохоче, але вище порогу сили в 100-200 пН стрибкоподібно подовжується приблизно на 25 нм. У цей момент розпрямляється окремий Ig-домен. Якщо розтягуюча сила від цього не ослабла, титин знову тягнеться спочатку неохоче, а потім подовжується ще на 25 нм, і так далі. Крок за кроком молекула «піддається» занадто великому впливу, який вона не може утримати, в надії, що після деякого значного подовження розтягуюча сила ослабне. Підкреслимо, що всі ці процеси обратими: як тільки вплив знімається, титин спокійно вкладається в свою природну (нативну) структуру.

Для того щоб це все вивчити експериментально, причому так, щоб не було різнобою в експериментальних умовах, дослідники домовилися проводити досліди на «вкороченій версії» цієї молекули, що складається з восьми Ig-доменів, без ділянки «м’якої» пружності. З одного кінця ця молекула прикріплена до пристрою, який тягне її з певною швидкістю. З іншого кінця її тримає голка атомно-силового мікроскопа, яка знаходиться на краю мініатюрного упругого підвісу — кантилевера. Під дією слабких сил кантилевер трохи згинається, цей вигин вдається зареєструвати, і тим самим можна виміряти чинну на нього силу. Дослідники запускають механічний пристрій, який повільно, але невблаганно подовжує молекулу, розплітаючи її. При цьому знімають показання з атомного силового мікроскопа, і в результаті виходить профіль сили залежно від подовження (рис. 3).

Ріс. 3. Експерименти з розтягнення «вкороченої версії» титину з восьми Ig-доменів і їх типовий результат — крива сили залежно від розтягнення молекули. Зображення зі статті Wolfgang A. Linke et al. 2002. PEVK Domain of Titin: An Entropic Spring with Actin-Binding Properties

Ця крива має характерну пилоподібну форму. Кожен зубець відповідає наростанню сили при розтягненні молекули, а після того як розплітається один з Ig-доменів, механічна напруга різко падає, і сила «стрибає» вниз. Так відбувається вісім разів, після чого виростає останній високий зубець, який вже не скомпенсувати ніяким розплітанням, і потім молекула відривається від кантилевера. Крім цих очевидних особливостей, крива містить і додаткову інформацію: це, наприклад, висота і профіль зубців, різкість падіння сили після розплітання чергового Ig-домену, однаковість зубців, а також залежність всього цього від швидкості розтягнення молекули. І виявляється, з цих дрібних характеристик можна отримати чимало інформації про процес розплітання титину.

Чи збігаються дані цих експериментів з результатами моделювання? На рис. 4 наведено порівняння (станом на 2009 рік) для однієї конкретної характеристики явища — критичної сили залежно від швидкості розтягнення. Видно, що критична сила в експерименті і в моделюванні відрізняється в кілька разів. Однак ці значення отримані при сильно різних швидкостях розтягнення! Типові швидкості подовження в експерименті не перевищували декількох мікрон на секунду, і при такій швидкості молекулі потрібно кілька мілісекунд для розпакування одного Ig-домену. Це величезний час за молекулярними масштабами; досить сказати, що для чесного розрахунку динаміки молекул крок за часом повинен бути порядку 1 фемтосекунди (10 ^‑ 15 с). Мільйон кроків — це лише 1 наносекунда; і те, до таких часів моделювання дотягнулося лише 10 років тому. Три роки тому суперкомп’ютер зміг прорахувати цілу мілісекунду — правда, тільки для невеликої молекули. А що стосується моделювання титину, то тут типові швидкості розтягнення становили сантиметри і навіть метри в секунду — інакше комп’ютер не встиг би промоделювати нічого цікавого. Фактично, моделювалося не розтягнення молекули, а, швидше, ривок. Найповільніше подовження, яке фізики змогли поки промоделювати, відповідало швидкості близько 3 мм на секунду, що все ще в тисячу разів перевершувало можливості експерименту.

Ріс. 4. Порівняння експериментальних даних і результатів моделювання станом на 2009 рік на прикладі критичної сили залежно від швидкості подовження. Видно, що область швидкостей, доступна експерименту (червоні і зелені точки), відрізняється від швидкостей, доступних у моделюванні (сині точки), майже в тисячу разів. Зображення зі статті Eric H. Lee et al., 2009. Discovery Through the Computational Microscope

У читача тут можуть виникнути два питання. По-перше, чому взагалі є різниця, з якою швидкістю розтягувати молекулу? Адже нам, за великим рахунком, хочеться дізнатися лише, які там діють сили та що в якому порядку розплітається. Причина знову-таки в тому, що титин — це «ентропійна пружина». Її пружність виникає не тільки через зростання потенційної енергії при розтягненні, але і за рахунок того, що молекула постійно змінюється, постійно «промацує» доступні їй просторові конфігурації. Якщо молекулу розтягувати повільно, то вона встигне під навантаженням промацати всі близькі конфігурації і «знайти» найоптимальніший шлях до розпакування Ig-домену. Але якщо швидкість різко збільшити, то молекула просто не встигне за виділений час знайти оптимальний шлях. В результаті при розтягненні ривком «ентропійність» пружини вже не важлива; процес розпакування стане більш грубим, механічним, несхожим на повільне подовження. Тому критична сила і зростає.

По-друге, може здивувати, що експерименти довго не могли прискорити розтягнення більше ніж до декількох мікрон на секунду. Звичайно, причина не в самому розтягненні, а в точності вимірювань. Під дією змінної сили кантилевер тремтить, і поки ця тремтіння не припинилася, він не може показувати правильні дані. При великих швидкостях руху ця тряска кантилевера замазувала всі реальні сили, які занадто швидко змінювалися з часом. Тому швидко розтягувати молекулу було просто безглуздо — ніяких даних отримати не вдалося б.

Нові результати

Ця складність, укупі з деякими супутніми труднощами, і була подолана в новій статті в Science. Її автори використовували екстремально короткий кантилевер, довжиною всього в кілька мікрон і з періодом вільних коливання менше мікросекунди. Здавалося б, зовсім незначне удосконалення! Але в результаті установка запрацювала на три порядку швидше, ніж класичний атомно-силовий мікроскоп, і крім того, їй відкрився величезний динамічний діапазон швидкостей — від 0,01 до 3870 мкм/с. Завдяки цьому дослідникам вдалося повністю перекрити весь недоступний раніше інтервал і вперше зіставити один з одним результати експерименту і моделювання. Крім того, завдяки високому тимчасовому дозволу вони змогли акуратно вивчити ті явища і виміряти ті величини, які раніше були недоступні прямому спостереженню.

Отже, насамперед дослідники переконалися, що при дуже низьких швидкостях їх вимірювання узгоджуються з даними минулих експериментів, а при високих швидкостях — з результатами моделювання (рис. 5). Таким чином, вони вперше перекинули місток через прірву, що розділяла ці два методи дослідження титину.

Ріс. 5. Ліворуч: профіль сил залежно від подовження при різних швидкостях розтягнення. Висота зубців відповідає критичній силі при даній швидкості. Праворуч: залежність критичної сили від швидкості; чорні точки — нові результати, квадратики — результати минулих експериментів, трикутники — результати моделювання. Зображення з обговорюваної статті в Science

По-друге, було вперше показано, що зростання критичної сили на цьому графіку не лінійне, а круто загинається вгору. Мабуть, це є вказівкою на те, що при швидкостях вище 1 мм/с змінюється режим розплітання молекули. Така поведінка передбачалася і раніше, але тільки зараз вона була наочно продемонстрована.

Ріс. 6. Профіль одного зубця при повільному розтягненні. Стрілкою вказано час, коли профіль «зривається» на злегка зсунуту криву. Зображення з обговорюваної статті в Science

По-третє, видно, що екстраполяція даних в область ще більших швидкостей, близько кілька сантиметрів в секунду і вище, пророкує набагато більші значення сили, ніж ті, що виходять в моделюванні. Чи є ця розбіжність чимось серйозним, поки сказати важко. Якщо воно підтвердиться в майбутньому, то це може означати, що в моделюванні зроблені деякі не цілком справедливі припущення про сили, що діють між частинами молекули. Таким чином, це порівняння допоможе поліпшити надійність обчислювальних результатів.

По-четверте, завдяки високій тимчасовій роздільній здатності вдалося виміряти профіль кожного зубця з недосяжною раніше точністю. У цих вимірах стала чітко видно одну особливість, на яку попередні експерименти тільки злегка натякали: при перевищенні деякого проміжного порогу сили зубець росте трохи повільніше, ніж спочатку (стрілка на рис. 6). Більш акуратні вимірювання показують, що зубець трохи зсувається вбік (кольорові криві на рис. 6). Такий перехід означає, що в цей момент відбувається невелике ослаблення пружності, і молекула трохи подовжується, приблизно на 0,9 нм (оцінки попередніх експериментів давали подовження всього на 0,3 нм). Підкреслимо — це відбувається до повного розплітання Ig-домену, але явно якось з ним пов’язано.

І дійсно, результати моделювання пророкують, що Ig-домен розплітається не миттєво, а спочатку переходить у проміжний стан. Зокрема, найперший етап — це розрив трьох водневих зв’язків між лід-тяжами, позначеними літерами A і B на рис. 7. Саме в цей момент відбувається попереднє подовження молекули якраз на 1 нм (що чудово узгоджується з новими даними), а вже потім, при ще більших навантаженнях, починають розплітатися й інші частини Ig-модуля.

Ріс. 7. Три початкові етапи розплітання Ig-домену в титині. Ліворуч: нативна структура, в центрі: проміжний стан з трьома розірваними зв’язками, праворуч: наступні етапи розплітання молекули. Зображення з сайту www.ks.uiuc.edu

По-п’яте, хоч це і не показано на графіках, але авторам вдалося витягти зі своїх даних різноманітні термодинамічні характеристики цього білка. Вони визначили енергію збудження проміжного стану і з’ясували, що вона цілком узгоджується з розривом трьох водневих зв’язків між ділянками A і B. Вони також з’ясували, при якому навантаженні активується цей проміжний стан, оцінили, скільки разів на секунду молекула перескакує з нативного стану в проміжний і назад, а також як швидко молекула повертається в нативний стан після зняття навантаження. Деякі з цих величин сильно відрізнялися від колишніх оцінок.

Автори закінчують свою статтю справедливим зауваженням, що область застосування їх установки не обмежується одним лише титином. На ній можна буде вивчати динаміку інших біологічно важливих молекул, які беруть участь у тих чи інших механічних процесах всередині клітини. Той факт, що ці вимірювання можуть тепер дотягнутися до результатів моделювання, дозволить уточнити програми моделювання і поліпшити загальне розуміння молекулярних біомеханічних процесів.

Джерело: F. Rico et al. High-Speed Force Spectroscopy Unfolds Titin at the Velocity of Molecular Dynamics Simulations // Science. 2013. V. 342. P. 741.

Див. також:

1) Урочистість комп’ютерних методів: передбачення будови білків, «Біомолекула», 26.03.2008.

2) Допомагати науці можна граючи, «Елементи», 01.09.2010.

Ігор Іванов