Про антифризи — білки і не тільки

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 66

Життя в полярних широтах складне і сповнене жахів. Солона морська і океанська вода не замерзає до _ 2 ° C, такий холод цілком може погубити живу істоту. Однак деякі тварини, неспроможні регулювати температуру власного тіла, пристосувалися до цих температур. Наприклад, окремі види риб дуже щасливі життям, яке ведуть у тунелях і дірках, що утворюються в плаваючих островах з морського льоду. Виживати в таких екстремальних умовах їм, як і багатьом іншим мешканцям полярних широт, допомагають сформовані в ході еволюції речовини — білки-антифризи, про які і піде мова.

Вперше ці речовини були відкриті під час вивчення антарктичних риб наприкінці 1960-х років. Відтоді минуло півстоліття, і виявилося, що багато інших біологічних організмів виробляють схожі за структурою з’єднання, які не дають крижаним кристалам утворитися в їхньому тілі. Риби, з вивчення яких все почалося, витримують охолодження тільки до — 1,9 ° C, а наземні організми можуть виживати в такі холоди, порівняно з якими — 2 ° C здаються спекою. Більш ефективні, ніж у риби, білки-антифризи знайдені у багатьох представників флори і фауни, а рекордсмени за холодостійкістю — жуки Dendroides canadensis, які проживають на Алясці, личинки яких подовгу зберігають життєздатність при температурі − 60 ° C і навіть переживають короткочасну заморозку до − 100 ° C (рис. 1).

Ріс. 1. Личинка жука Dendroides canadensis виживає при негативних температурах завдяки білкам-антифризам

Незважаючи на значні відмінності в будові цих сполук, з’являються нові і нові свідчення на користь того, що всі природні «незамерзайки» працюють за близьким і не особливо складним механізмом. Він цікавий не тільки фахівцям з тваринного і рослинного світу Арктики і Антарктики: знання того, як працюють природні антифризи, вже використовується на практиці.

Кров не крижає

Білки-антифризи привертають увагу медиків і виробників заморожених напівфабрикатів в першу чергу біологічною сумісністю, а також і тим, що принцип дії цих речовин кардинально відрізняється від антифризів, що застосовуються, наприклад, для захисту двигунів автомобілів. Головний компонент вірного зимового друга автолюбителя — етиленгліколь — знижує температуру замерзання води за рахунок колігативних ефектів: при додаванні його до розчину збільшується неупорядкованість рідкої системи, і температура замерзання знижується. За таким же принципом знижують температуру танення солі, що входять до складу протиожеледних реагентів. Саме через розчинені в морській воді солі її температура замерзання «йде в мінуса» і в середньому становить — 2 ° C.

У 1960-ті роки дослідники, які вивчали кров антарктичних риб, намагалися визначити сполуки, що знижують її температуру замерзання. Тоді передбачалося, що морозостійкість мешканців полярних широт теж пов’язана з колігативними ефектами, тому дослідники шукали багатоатомні спирти (поліоли) та інші низькомолекулярні сполуки, близькі по будові до антифризів, що використовуються в техніці. Уявлення того часу про фізичну хімію розчинів дозволяли з упевненістю виключити білки зі списку потенційних антифризів — їх концентрації в крові та інших біологічних рідинах полярних тварин занадто малі, щоб вони могли знижувати температуру замерзання за тим же механізмом, що поліоли і солі. Разом з тим виділені з крові цих риб низькомолекулярні речовини також не могли пояснити, чому кров не замерзає.

Загадку зміг розгадати фахівець з біології полярних риб Артур Девріс (Arthur DeVries), який опублікував результати свого дослідження в 1969 році (Science, 1969, 163, 3871, 1073-1075, doi: 10.1126/science.163.3871.1073). Він вперше встановив, що незвичайний виділений з крові полярних риб глікопротеїд — біомолекула, в якій вуглеводний фрагмент пов’язаний з поліпептидним ланцюгом, — не дає їх крові перетворитися на лід (рис. 2).

Рис, 2. Трематома-строкатий Trematomus bernacchii — героїня статті Девріса 1969 року

Незабаром до дослідницької групи Девріса приєднався Джон Дюман. Темою його роботи була ідентифікація речовин, що знижують температуру замерзання крові організмів, які мешкають на іншому полюсі Землі, в арктичних регіонах. Дюману пощастило виявити білок-антифриз зимової камбали Pseudopleuronectes americanus (рис. 3). Цей білок, на відміну від того, який виявив Девріс, не містив вуглеводного фрагмента (Nature, 1974, 247, 5438, 237-238, doi: 10.1038/247237a0). Виявлення другого білка-антифризу на якийсь час спантеличило вчених — такими різними по будові виявилися дві біомолекули, що відповідають за однакові властивості.

Рис, 3. Зимова камбала Pseudopleuronectes americanus

Захистивши дисертацію і почавши власну наукову кар’єру, Дюман переключився на вивчення морозостійких комах, якими він і займається донині. Один з найцікавіших об’єктів в цій області — вже згаданий жук Dendroides canadensis: його організм виробляє найбільш потужні білки-антифризи. У первинній структурі (тобто просто в амінокислотній послідовності) одного з цих білків регулярно зустрічаються залишки треоніну і цистеїну, причому цистеїни утворюють дисульфідні містки, укладаючи білок зигзагом. Вторинна структура білка-антифриза — лід-складчаста, а третинна забезпечує рівномірний розподіл гідроксильних груп треоніну по одній плоскій стороні білка (рис. 4). Детальна будова цих білків відрізняється не тільки у різних підвидів D. canadensis, але навіть у комах, що належать до одного біологічного виду. Дюман і його колеги змогли виявити близько 30 різних підтипів білків-антифризів, будова яких забезпечує найбільш ефективну роботу в різних відділах організму жука (або його личинки), від травної та кровоносної системи до покровних тканин.

Рис, 4. Білок-антифриз DAFP-1 жука D. canadensis. З і Т — залишки цистеїну і треоніну. Цей білок не глікозильований, вуглеводних груп у нього немає. Знизу третинна структура того ж білка. Всі залишки треоніна дивляться в одну сторону — ця сторона і буде взаємодіяти з крижаними кристалами

Рис, 5. Кристалічна структура білка-антифриза жука Rhagium inquisitor зі зв’язаними молекулами води. Гідрофільні фрагменти треоніну позначені стрижневими моделями, вода — сферами, дисульфідні зв’язки між залишками цистеїну показані стрілками

Пітер Девіс, біохімік з канадського Університету Королеви Марії, що вивчає співвідношення «структура — властивості» білків-антифризів, зазначає, що будова цих білків залежить від того, до якого царства належить організм, що виробляє антифризи, і від приблизного часу, коли тварина або рослина (або їх еволюційні предки) змогли «створити» білки, що захищають від холоду. В даний час серед них відомі білки і зі спіральною, і зі складчастою вторинними структурами, і прості, і складні, з глобулярною або фібрилярною третинною структурою.

Проте у них, за словами Девіса, є загальні структурні мотиви. Зазвичай одна з поверхонь білків-антифризів плоска, досить часто гідрофільна, в деяких випадках на ній розташовуються регулярно повторювані групи (рис. 5). Саме завдяки цій поверхні і знижується температура замерзання — з нею зв’язуються зароджувані кристаліки льоду, а вона обмежує їх подальше зростання.

Від теорії до практики

Ще в 1971 році Девріс припустив, що білки-антифризи можуть перешкоджати зростанню кристалів льоду (Science, 1971, 172, 3988, 1152-1155, doi: 10.1126/science.172.3988.1152). Це припущення блискуче підтверджується при вивченні форми кристалів, що утворюються в присутності білків-антифризів. Зазвичай кристали льоду формуються у вигляді призм з шістьма прямокутними гранями і двома шестикутними підставами, причому площа підстав менше площі бічних граней. Білки-антифризи риб пов’язуються з прямокутними гранями крижаної призми, не дозволяючи новим молекулам води приєднуватися до них. Доступними для молекул води залишаються тільки шестикутні грані-основи, що значно уповільнює зростання кристалів.

Для підтвердження цього механізму Девіс і його колеги проводили спрямований мутагенез, змінюючи певні ділянки різних білків-антифризів, і переконливо довели, що за зв’язування льоду відповідає саме плоска гідрофільна поверхня білка. В даний час дослідники вважають, що вони впритул підійшли до розуміння взаємодій білка і кристалів льоду на молекулярному рівні.

Сумне око зимової камбали. Може бути, їй холодно?

Як пояснює Девіс, механізм, який в даний час запропонований для білків-антифризів риб, можливо, застосовний до всіх білків, що збирають на одній зі своїх поверхонь воду і кристали льоду. Передбачається, що він нагадує механізм утворення шару квазіжидкої води на крижаних кристалах, тільки замість квазіжидкої води з кристалом льоду взаємодіють гідрофільні фрагменти білка.

Хоча такий шар білка, що імітує поведінку квазіжидкої води на поверхні кристала льоду, поки неможливо спостерігати безпосередньо, Девіс з колегами, використовуючи кристалографічне дослідження білків і їх квантово-хімічне моделювання, зібрали достатньо свідчень на користь такої моделі. Девіс заявляє, що великим проривом було б детальне вивчення кристалічних структур надмолекулярних асоціатів білків-антифризів з льодом. За його словами, результати комп’ютерного моделювання вільних білків дуже добре узгоджуються з результатами їх дослідження за допомогою рентгеноструктурного аналізу, однак для остаточного виведення необхідно отримати ще й кристалічні структури білків, пов’язаних з водою.

Білки-антифризи цікаві не тільки з точки зору еволюційної і молекулярної біології, вони вже знайшли практичні застосування. Так, у деякі сорти морозива фірми Unilever додають «лід-формуючий білок» — так у списку інгредієнтів називають білок-антифриз. Він потрібен не для того, щоб знизити температуру замерзання морозива (і звичайно ж не для того, щоб отримати десерт зі смаком риби), тут експлуатується інший талант білків-антифризів — здатність обмежувати розміри кристалів. Навіть при невеликій добавці такого білка текстура морозива зберігається після дуже глибокої заморозки, кристалики льоду не хрустять на зубах. Продукти харчування, що містять білки-антифризи, продаються в США і Австралії з початку 2000-х років, а в 2009 році Unilever отримав і дозвіл Євросоюзу. Зрозуміло, в промислових кількостях ці білки виділяють не з мешканців полярних широт, а з генетично модифікованих дріжджів.

Застосування білків-антифризів стримується страхом потенційних споживачів перед ГМО. Так, за словами Девіса, одне з цікавих завдань, які можна було б вирішити, — виведення стійких до низьких температур лососевих риб. Ідея проста: потрібно впровадити в геном риби або навіть рослини ген, що відповідає за синтез білка-антифриза. Це дозволило б продовжити час вирощування рослин, а також вирощувати сільгоспкультури або промислову рибу в набагато більш холодних регіонах. В даний час у дослідників достатньо інформації, щоб отримати ГМ-лосося, настільки ж стійкого до холоду, як ендемічні для Арктики і Антарктики риби. До речі, швидкозростаюча генно-модифікована сьомга AquAdvantage від компанії AquaBounty Technologies вже визнана безпечним харчовим продуктом в США і Канаді. Однак поки немає впевненості в тому, що у власників рибогосподарств і споживачів буде користуватися попитом морозостійкий лосось.

Кріоконсервація: чим замінити природні антифризи?

Інша можлива область застосування білків-антифризів — кріоконсервація органів, призначених для трансплантації. Однак тут ці біомолекули зарекомендували себе не так добре, як багато хто сподівався. При контакті з біологічними тканинами, що зазнають кріозбереження, білки-антифризи більше шкодять їм, ніж захищають від пошкодження. Проблеми виникають при розморожуванні донорського органу. Як пояснює фахівець з хімії біополімерів з Університету Уорвіка Метью Гібсон, зовнішня частина органу починає відстоювати швидше внутрішньої, це призводить до диспропорції в поглинанні енергії в різних ділянках органу, в результаті може початися швидке повторне утворення кристалів льоду, які і пошкоджують донорський орган. Здатність білків-антифризів блокувати підхід води до бічних гранів крижаних призм в даному випадку грає злий жарт: кристали ростуть тільки з боку підстав, утворюються тонкі і гострі крижані голки, які протикають клітинні мембрани і викликають деякі інші проблеми.

Гібсон з колегами намагаються знайти матеріали, здатні інгібувати кристалізацію льоду, не знижуючи температуру замерзання води і не формуючи кристали льоду з небезпечною формою. У пошуках подібних з’єднань дослідники вирішили випробувати ряд синтетичних полімерів, здатних зв’язувати воду.

Дослідження, проведене в групі Гібсона, призвело до несподіваного результату. Виявилося, що полівініловий спирт — продукт великотоннажного виробництва, до того ж дозволений до застосування в ряді країн в якості харчової добавки, — теж інгібує кристалізацію води при низьких температурах (Polymer Chemistry, 2010, 1, 1141-1152, doi: 10.1039/C0PY00089B). Механізм антифризної активності полівінілового спирту ще менш вивчений, ніж механізм роботи білків-антифризів; загадковості додає і та обставина, що синтетичні полімери не утворюють регулярних третинних структур, подібних до білків. Єдине, про що з упевненістю говорять полімерники з Уорвіка, — збільшення молекулярної маси полімеру призводить до зростання його антифризної активності.

Припущення, що для полівінілового спирту розмір має значення, спростовується низкою робіт, в яких показано, що інгібувати зростання кристалів льоду можуть і низькомолекулярні речовини, правда, знову ж таки здатні зв’язатися з водою (рис. 6). У 2012 році Роберт Бен з Університету Оттави виявив, що зниження температури замерзання води і уповільнення її кристалізації можуть викликати низькомолекулярні повірісно-активні речовини — октілгалактопіранозид і октілглюконамід (Chemical Science, 2012, 3, 1408-1416, doi: 10.1039/C2SC00885H). У 2016 році хіміки з Нью-Йорка спостерігали інгібування зростання кристалів льоду сафранином — барвником, який використовують у біохімічних дослідженнях для підфарбовування клітинних ядер (Journal of American Chemical Society, 2016, 138, 40,  13396-13401, doi: 10.1021/jacs.6b08267). Дослідники припускають, що механізм роботи низькомолекулярних антифризів трохи інший, ніж у високомолекулярних, — малі молекули з гідрофільними фрагментами просто розміщуються на кристалі льоду і порушують стійкість кордону розділу між шаром квазіжидкої води, навколишньою кристал, і звичайною рідкою водою, що також не дає льоду рости. Зауважимо, що колігативні ефекти, характерні для інших низькомолекулярних сполук — солей і багатоатомних спиртів, в даному випадку, так само, як і для білків, не відіграють особливої ролі.

Рис. 6. Низькомолекулярні природні антифризи

Не білками єдиними

З 1969 року, коли Артур Девріс виявив перший білок, що захищає полярних риб від холоду, почалася гонка, метою якої були аналогічні або схожі білки інших біологічних видів. У 1960-1970-ті роки всі наполегливо шукали тільки білки, можливо, тому відкриття природного антифризу, що не має білкової будови, довелося чекати кілька десятиліть.

Таку речовину виділив з організму морозостійкого жука Upis ceramboides все той же Джон Дюман (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2009, 106, 48,  20210-20215, doi: 10.1073/pnas.0909872106). У його лабораторії кілька місяців намагалися очистити виділений з личинки жука білок, але всі спроби отримання чистої фракції виявлялися невдалими. Як з’ясувалося потім, речовина, яку намагалися чистити як білок, зовсім не була білком, а являла собою гліколіпід — речовина, що містить вуглеводний і ліпідний фрагменти. (Оскільки до ліпід відносять будь-які гідрофобні молекули, октілгалактопіранозид з октілглюконамідом цілком можна вважати синтетичними гліколіпідами.)

Після відкриття гліколіпідного антифризу в 2009 році Дюман і його колеги змогли виділити інгібуючі зростання льоду гліколіпіди з одного виду рослини, шести видів комах і однієї жаби, тому можна припустити, що ці речовини також часто використовуються в природі для захисту від холоду. На відміну від білків-антифризів гліколіпіди-антифризи, швидше за все, забезпечують захист клітинних мембран. Як вважає Дюман, деякі види виробили особливий спосіб боротьби з низькими температурами: хоча їхня позаклітинна рідина і замерзає, гліколіпіди перешкоджають проникненню льоду через мембрану і фатальному для організму замерзанню внутрішньоклітинної рідини. Якщо це припущення підтвердиться, то антифризи природного походження для кріоконсервації органів буде логічніше шукати серед гліколіпідів.

У ці зимові дні, піднімаючи комір, як вітрил грудня, намагаючись швидше потрапити з дому на роботу, з роботи додому, щоб поменше залишатися на морозній вулиці, не забудьте, що є чимало організмів, для яких температура, звичайна для наших грудневих і січневих морозів, — не привід для відчаю і анабіозу. Зберігати активність, жити і залишати потомство при низьких температурах цим організмам допомагають антифризи природного походження — білки і гліколіпіди.