Про молекулярні механізми виникнення пухлин

admin

2 года назад

Про молекулярні механізми виникнення пухлин

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 75

Про автора

Трохи історії
Гени-активатори та гени-супресори
Специфічні властивості пухлин і молекулярні механізми раку
Епігенетичні порушення

Федір Львович Кисельов — член-кореспондент РАМН, професор, доктор біологічних наук, керівник відділу трансформуючих генів пухлин НДІ канцерогенезу Онкологічного наукового центру ім. м. М. М. Блохіна. Займається вивченням молекулярних механізмів канцерогенезу.

Перше десятиліття XXI ст. принесло приголомшливі дані про механізми виникнення пухлин і змінили наші уявлення про ці хвороби. Які підходи до діагностики та терапії відкрили нові знання? Спробую розповісти про все це.

Трохи історії

Виникнення молекулярної онкології в другій половині минулого століття було пов’язане з виявленням двох типів генів: стимулюючих клітинне зростання (онкогенів), і, навпаки, обмежують його (генів-супресорів) [1]. Як тоді припускали, саме взаємодія цих генів служить основною причиною неконтрольованого зростання клітин, тобто поява пухлини. Такі революційні для онкології факти мають свою історію.

Величезну роль у розвитку молекулярної онкології, на мій погляд, зіграла вірусна теорія походження пухлин, висловлена Л. А. ^{Зільбером1} в середині 40-х років і через 20 років отримала загальне визнання як вірусогенетична теорія походження пухлин [2, 3]. Її основні положення свідчили:

всі пухлини людини викликаються вірусами;
вірус лише ініціює переродження нормальної клітки в пухлинну;
вірусна нуклеїнова кислота вбудовується в геном клітини, модифікуючи її генетичну програму так, що клітина стає безсмертною.

Перший і єдиний вірус у людини виділили наприкінці 60-х років у дітей, які страждають однієї з форм онкологічної хвороби в Африці, — це був вірус лімфоми Беркітта. У 70-80-х роках вірусна теорія продовжувала свою тріумфальну ходу — було виявлено велику кількість РНК- і ДНК-вірусів, що викликають пухлини у різних видів ссавців і птахів.

Вивчення РНК-містять онкогенних вірусів дозволило зробити новий, принциповий крок у розумінні механізмів злоякісного зростання. У птахів ці віруси діляться на дві основні групи: зухвалі або лейкози, або саркоми.

Виявилося, що РНК вірусу курячої саркоми Рауса, що призводить до розвитку пухлини у птахів і до злоякісного переродження (трансформації) культивованих клітин, містить фрагмент, який відсутній в РНК лейкозних вірусів. З’ясувалося, що саме він відповідає за трансформацію клітин, здатних до необмеженого розмноження в культурі клітин, а при введенні чутливою твариною викликає у них пухлини. Фрагменти геному зі схожими властивостями виявили у всіх РНК-вірусах, які ініціюють пухлини, і назвали їх онкогенами. За ці роботи, виконані в кінці 70-х років, М. Бішоп і Х. Вармус в1989 р. були удостоєні Нобелівської ^{премії2}.

Вивчення геному пухлинних клітин, заражених саркомними вірусами, принесло нову сенсацію — гомологи вірусних онкогенів є у всіх нормальних клітинах. Природно виникло питання: чому ж у них не проявляється онкогенний потенціал? І чи проявляється він взагалі? І якщо так, то як?

Гени-активатори та гени-супресори

Вивчення структури клітинних онкогенів (протоонкогенів), їх локалізації на хромосомах, ролі в житті клітини і можливих механізмів активації показало, що протоонкогени дійсно можуть здійснювати контроль за поділом клітин [1-3]. В якості індукторів клітинного розмноження мовчущі протонкогени здатні активуватися в результаті наступних генетичних процесів:

точкових мутацій у кодуючих послідовностях онкогену, що змінює структуру його білкового продукту, відповідно і взаємодію білка з мішенню;
переміщення окремих фрагментів між хромосомами (транслокації);
ампліфікації гена (збільшення його копійності);
посилення роботи деяких онкогенів у багатьох пухлинах, тобто підвищений синтез білкового продукту.

Важливим кроком стало також з’ясування ролі онкобілків при проходженні сигналу до поділу (активної проліферації) від клітинної поверхні в ядро. В результаті були виділені чотири групи таких білків. До першої входили позаклітинні ростові фактори; у другу — продукти онкогенів, що служать рецепторами для цих факторів (рецепторні тирозінкінази); у третю — онкобілки (кодовані онкогенами сімейства RAS і велика група серін-треонінових кіназ), що здійснюють передачу ростового сигналу в ядро; у четверту — продукти ядерних онкогенів (MYC, JUN, MYB), здатні контролювати синтез ДНК. Особливо цікаві кінази, які фосфорилюють білки-мішені по тирозину, також по двох інших амінокислотах — серину і треонину.

Отже, до кінця минулого століття стало ясно, що в геномі нормальних клітин є досить велика кількість генів — потенційних індукторів пухлинного зростання. Вони функціонують на різних етапах передачі сигналу до розмноження клітин, а їх активація може призводити до безконтрольного клітинного поділу, тобто до утворення пухлини.

Інша група генів — це супресори пухлинного зростання [4]. Перший з них — ген ретинобластоми (Rb). Його існування постулював в 1971 р. А. Кнудсон, вивчаючи спорадичні та спадкові форми пухлин сітківки ока (ретинобластоми) [5]. Цитогенетичними дослідженнями на хромосомі 13 була виявлена невелика делеція, в якій потім ідентифікували ген Rb (він був або загублений, або інактивований в ретинобластомах). Пізніше ген Rb клонували. Він володіє супресорним ефектом на трансформовані клітини і працює у всіх нормальних клітинах, в яких його продукт (pRb105) обратим фосфорильований. У неподільних клітинах він втрачає залишок фосфорної кислоти і утворює комплекси з білками (гістоновими деацетилазами — HDAC), що викликають зміни хроматину, і з транскрипційними факторами сімейства E2F.

Функції гена-супресора Rb у клітинах. CDK4/6 — одна з циклін-залежних кіназ, що регулюють активність цього гена; p16 — інгібітор кінази; E2F — транскрипційний фактор, що грає ключову роль у транскрипції. Внизу наведено основні фази клітинного циклу: G0 — клітинного спокою, G1 — підготовки до синтезу ДНК, S — реплікації ДНК, G2 — активного зростання клітин, М — фаза ділення клітини (мітоз)

Ці фактори — основні регулятори синтезу білків, що контролюють нормальний клітинний цикл. Транскрипція їх генів придушена, коли фактор E2F знаходиться в комплексі з Rb/HDAC. При мітогенному сигналі в початковій фазі (G1) клітинного циклу білок Rb фосфорилюється однією з циклін-залежних кіназ (ферментів, що регулюють клітинний цикл), а фактор E2F, який активує багато генів, в тому числі і необхідні для синтезу ДНК, звільняється. Після переходу клітини в S-фазу білок Rb втрачає залишки фосфорної кислоти (дефосфорилюється). Крім клітинного циклу ген Rb через свій продукт бере участь у диференціюванні клітин, репарації ДНК та її реплікації, а також у регуляції апоптозу. Таким чином, ген Rb, модулюючи через свій білок активність транскрипційного фактора E2F і регульованих ним генів, відіграє ключову роль у контролі послідовних подій, що забезпечують життєвий цикл клітини. Значна частина мутацій гена Rb (крім ретинобластоми вони виявлені і в інших пухлинах) призводить або до втрати його функцій, або до припинення синтезу РНК, або до утворення білка зі зміненою структурою. Транскрипційний фактор E2F при цьому знаходиться в перманентно активованому стані. У підсумку негативна регуляція клітинної проліферації припиняється.

Ще один широко поширений ген-супресор пухлинного зросту кодує білок з молекулярною масою 53 кДа, звідси і його назва — p53 [4]. У пухлинах людини цей ген найбільш схильний до мутацій — вони виявляються більш ніж у 50% випадків і розподілені по всьому гену. У нормальних клітинах p53 володіє дуже слабкою транскрипційною активністю. Модифікації, що відбуваються при стресах або внутрішньоклітинних пошкодженнях, які змінюють структуру білка, істотно збільшують транскрипційний потенціал p53. Основними мішенями при цьому служать білки, що контролюють апоптоз і клітинний цикл. Отже, р53 у разі будь-яких серйозних впливів на ДНК відповідає за «охорону» клітин: або індукує репарацію пошкоджень, або зупиняє клітинний цикл, або стимулює клітини зі зміненим геномом до апоптозу.

Мутації в гені р53 — найбільш часто зустрічувана зміна в пухлинах. Прямокутники — частота певного раку на 250 тис. населення; числа праворуч — кількість (%) пухлин з мутаціями р53 в даному типі раку

В даний час є більше 100 генів-мішеней для транскрипційної активності р53. Серед них можна виділити кілька функціонально різних груп: контролюючі через свої продукти апоптоз; ангіогенез (формування нових судин у пухлині); регулюючі клітинний цикл (це цикліни, циклін-залежні кінази та їх інгібітори); морфологію та/або міграцію клітин. Одна з важливих функцій р53 — репресія гена каталітичної суб’єдиниці теломерази, ферменту, важливого в реплікативному старінні клітин. Отже, зміна активності гена р53 забезпечує появу характерних для неопластичних клітин властивостей, які за короткий термін змінюють їх генетичну програму. Це пояснює той факт, що в пухлинах різних типів мутації в р53 зустрічаються частіше, ніж в інших генах. Згадані гени-супресори не єдині, до теперішнього часу їх виявлено більше 10 і з кожним роком їх кількість зростає, причому їх функціональна активність специфічна для різних пухлин.

Дослідження генів, які через кодовані ними білки контролюють проліферацію клітин і відіграють головну роль в їх безконтрольному поділі, проведені в основному в кінці минулого століття, переконливо показали, що рак — захворювання генетичного апарату клітин. Отже, точні знання про всі генетичні складові канцерогенезу і порівняння нуклеотидних послідовностей ДНК в пухлинних і нормальних клітинах абсолютно необхідні. Такі роботи стали можливими після того, як геном людини був повністю розшифрований.

Специфічні властивості пухлин і молекулярні механізми раку

Однак перш ніж перейти до розгляду цих даних, повернемося до початку статті — до питання про роль вірусів у виникненні пухлин людини.

Якщо в 1960-х роках було виявлено тільки вірус лімфоми Беркітта, що належить до групи герпесів і призводить до лімфоми в африканських дітей, то до кінця століття стали відомі ще кілька вірусів, пов’язаних з пухлинами людини. Це ДНК-містять віруси: герпеса тип 8 (або саркоми Капоші), що викликає один з видів саркоми шкіри; гепатиту В, з високою частотою виявляється в пухлинах печінки; декількох типів папілом людини (етіологічний агент при раку шийки матки) і саркоми Меркеля³, що належить до вірусів групи Papova (віруси поліоми і SV40, які викликають пухлини у мишей і мавп). З пухлинами людини асоційовані також два РНК-містять вірусу — гепатиту С в пухлинах печінки (механізм прояву його онкогенного потенціалу ще точно не встановлений) і T-клітинного лейкозу дорослих, пов’язаний тільки з однією і рідкісною формою лейкозу в декількох ендемічних районах світу. РНК цього вірусу схожа за своєю структурою з іншими лейкозними вірусами ссавців і птахів.

До теперішнього часу встановлено основоположні принципи, за якими віруси змінюють генетичну програму клітин, модифікуючи її таким чином, що клітина втрачає контроль над власним поділом. ДНК-віруси містять гени, білкові продукти яких інактивують гени-супресори пухлинного зростання, а в РНК-вірусах є гени, що опосередковано прискорюють процеси клітинної проліферації [6, 7].

З усіх пухлин людини за частотою зустрічності близько 20% асоційовані з вірусами. Великим досягненням у боротьбі з раком стало створення полівалентної вакцини проти пухлин шийки матки, викликаних вірусами папіломи. Застосування вакцини практично повністю виключає появу передпухлинних уражень і ^{пухлинних 4}.

Пухлини людини, виникнення яких пов’язане з вірусами. На осі абсцис — типи пухлин, виникнення яких пов’язане з вірусами. На осі ординат — показник (%) летального результату, викликаного певним типом раку від загальної кількості смертності від усіх пухлин

З настанням XXI ст. почався новий етап у розумінні молекулярних механізмів пухлинного зростання. Прогрес йшов у двох напрямках: вивчалися біологічні властивості пухлинних клітин, що відрізняють їх від нормальних; і велася робота з розшифровки молекулярних механізмів, що контролюють виникнення цих специфічних властивостей. У 2011 р. з’явився огляд, в якому були підсумовані ознаки пухлинних клітин [8]:

відсутність необхідності додаткових сигналів до поділу (проліферації);
втрата здатності реагувати на сигнали, які стримують проліферацію;
уповільнення процесів програмованої клітинної загибелі (апоптозу);
необмежений реплікативний потенціал (подолання так званого ліміту Хайфліка — не більше 30-50 циклів реплікації);
інвазія і метастазування (поширення пухлинних клітин всередині ураженого органу та їх перенесення кров’ю в інші органи, насамперед у лімфовузли) — ключові стадії злоякісного росту;
геномна нестабільність (прискорене накопичення мутацій);
формування судин у пухлині, без яких неможливе накопичення пухлинної маси (активація ангіонеза).
адаптація оточуючих пухлинне вогнище стромальних компонентів до потреб його зростання;
вислизання від імунного нагляду, пов’язане, можливо, з селекцією певного клону пухлинних клітин, які в найменшій мірі змінюють свою антигенну структуру;
запалення, що майже завжди передує і/або супутнє пухлинному зростанню і створює сприятливе середовище для збільшення клітинної маси;
аеробний гліколіз, який, мабуть, може підтримувати злоякісне зростання, сприяючи більш ефективному синтезу макромолекул і органелл, необхідних для нових клітин.

Розшифровка на початку XXI ст. генома людини стимулювала стрімкий прогрес у вивченні молекулярних механізмів злоякісного зростання. З «явилася можливість порівнювати геноми нормальної та пухлинної клітин, тобто їхню повну нуклеотидну послідовність ДНК [9]. Такі роботи проводилися величезними науковими інтернаціональними колективами, які включали десятки лабораторій і сотні дослідників. В результаті виявилося, що в геномі пухлинних клітин мутації виникають в десятки разів частіше, ніж в нормальних клітинах. Здебільшого ці мутації не впливають на онкогенний потенціал клітини, тому їх назвали пасажирами. У запуску злоякісного перетворення клітин бере участь лише невелика частина соматичних мутацій (їх називають водіями; англійською driver). Саме вони особливо цікаві як потенційні мішені для протипухлинної терапії.

Визначено також широкий спектр генетичних пошкоджень в пухлинах — від точкових мутацій до мікроделецій (втрати декількох нуклеотидних пар) або мікроінсерцій (включення додаткових пар нуклеотидів). Їх наслідки, як правило, зводяться до зміни структури кодованого мутантним геном білка, в результаті чого він втрачає здатність взаємодіяти з мішенню. У ряді випадків нуклеотидні заміни можуть призводити до утворення стоп-кодона, тобто до зупинки синтезу повнорозмірного білка і, значить, до втрати його природних функцій. Фенотипічні прояви мікроделецій і мікроінсерцій безпосередньо залежать від кількості залучених нуклеотидів. Якщо їх число кратно трьом, то рамка зчитування і функції білка зберігаються (три нуклеотиди можуть кодувати одну амінокислоту). Так активується рецептор епідермального фактора зростання EGFR (epidermal growth factor receptor) в пухлинах легенів. Однак у більшості випадків при втраті або появі нових нуклеотидів рамки зчитування зсуваються (при цьому порушується послідовність нуклеотидів, що кодують нормальний білок) і тоді синтезується неправильний білок, позбавлений активності. Для більшості генів-супресорів характерний саме такий механізм.

Багато пухлин відрізняються нестабільністю протяжних ділянок хромосом, тому для них типові порушення копійності (ампліфікації) генетичного матеріалу. При її збільшенні кількість білкових продуктів онкогенів зростає. Значно частіше ампліфікацій зустрічаються делеції ділянок хромосом.

Транслокація ділянки хромосоми 9, що містить онкоген ABL, на хромосому 22 в район ділянки BCR, в результаті чого утворюється хімерний ген BCR/ABL. Така хімічна хромосома 9, що отримала назву філадельфійської, служить маркером хронічного мієлоїдного лейкозу

Ще один приклад макромутацій в пухлинах — транслокації ділянок хромосом, які змінюють активність генів або призводять до утворення хімерних білків. Такі мутації характерні головним чином для онкогематологічних патологій. Прикладом є перебудова BCR/ABL, що лежить в основі хронічного мієлоїдного лейкозу, або транслокації тирозінкіназних генів ALT і RET, що спостерігаються в карциномах легенів.

Загалом, у перетворенні нормальної клітини на пухлинну бере участь ауд 400 генів, що несуть мутації, що становить близько 2% генів, які кодують білки. Виявлено від 1000 до 10 тис. можливих мутаційних заміщень в пухлинах молочних залоз, яєчників, при колоректальному раку, раку підшлункової залози і гліомах (пухлинах мозкової оболонки). Істотно менше мутацій виявлено в пухлинах мозку, яєчка, гострих лейкозах, а найбільш агресивні пухлини легенів і меланому містять понад 10 тис. генетичних змін. Таким чином, множинні мутації представляють неодмінний атрибут пухлинної клітини, але їх спектр специфічний для кожної конкретної пухлини, тобто кожна з них має власну генетичну програму.

Повна розшифровка генома людини показала, що в синтезі структурних білків, необхідних для функціонування клітини, бере участь менше 10% її геному. А які функції решти 90% нуклеотидних послідовностей ДНК і як регулюється робота мутантних генів? Ці запитання мали знайти відповіді.

Епігенетичні порушення

Подальші дослідження переконливо продемонстрували, що пухлинним клітинам притаманні два типи генетичних порушень — мутаційні та епігенетичні. Останні виникають при різних патологіях, включаючи пухлини, не пов’язані з порушенням первинної структури гена. До таких епігенетичних змін відносять:

метилювання ДНК (приєднання метильної групи до цитозину);
посттрансляційні модифікації гістонів (основної групи білків, що формують хроматин);
розташування нуклеосом на ДНК;
утворення та функціонування некодуючих РНК (мікроРНК).

Зупинимося на питаннях, пов’язаних з метилуванням ДНК, модифікацією гістонів і функціонуванням мікроРНК, насамперед тому, що вони можуть становити інтерес для клінічної практики. Метилювання цитозину в складі ДНК було відкрито Б. Ф. Ванюшиним і А. Н. Білозерським ще в середині 70-х років. Вони показали, що в тварин клітинах відбувається метилювання цитозину в парі нуклеотидів гуанін-цитозин (CpG), які розкидані по всьому геному. Сьогодні ми знаємо, що в геномі людини існує безліч ділянок, збагачених цією парою (так звані CpG-острівці), але тільки їх метилювання всередині промоторів (ділянок ДНК, з яких починається синтез РНК) і перших екзонів гена пригнічує його роботу. Процес цей успадковується кліткою, але він звернемо. Такі агенти, як 5-азацитидин, відщеплюють метильну групу, що призводить до активації транскрипції. У пухлинних клітинах часто метилуються гени, що грають головну роль у канцерогенезі. До них належать гени, що пошкоджують ДНК і репаріюють її; гени-супресори; регулятори апоптозу, адгезії клітин; гени, які беруть участь в ангіогенезі, імунній відповіді; гени мікроРНК.

Схема основних епігенетичних змін в пухлинній клітині — метилювання ДНК та ацетилювання гістонів

Таким чином, метилювання генів, що контролюють основні етапи проліферації, може надавати той же ефект на розвиток пухлин, що і структурні мутації. Зараз метилювання прийнято позначати терміном «епімутація», оскільки воно не змінює нуклеотидну послідовність гена. Метилування можуть піддаватися й інші CpG-збагачені ділянки всередині гена, але, як і в разі мутацій-пасажирів, принципових змін у функціональній активності гена не відбувається.

Важливо доповнити, що метилування може проявлятися на найбільш ранніх стадіях канцерогенезу і у всіх типах пухлин, але набір метильованих генів специфічний для кожної [10].

Ще один рівень регуляції транскрипції — це модифікація гістонів, ядерних білків, що утворюють комплекс з ДНК (хроматин). Відомі чотири види гістонів. Дві молекули кожного з них складають нуклеосому — структуру, обвиту фрагментом ДНК довжиною 146 нуклеотидних пар. Наразі виявлено 16 модифікацій гістонів, які можуть змінювати конформацію нуклеосоми і таким чином впливати на реплікацію ДНК і транскрипцію. З можливих модифікацій добре вивчені метилування та ацетилювання, що каталізуються специфічними гістоновими ферментами, які здійснюють і зворотний процес. Зараз вже отримані картини розподілу ацетилювання і метилювання гістонів в первинних пухлинах і в культивованих пухлинних клітинах. Для останніх характерна значна втрата метиліювання гістона N4, який є одним з маркерів неактивного хроматину [11, 12].

Інша область епігеноміки пухлин, що стрімко розвивається, — вивчення некодуючих РНК [13]. В ході досліджень за міжнародною програмою ENCODE (the ENCyclopedia of DNA Elements) з’ясувалося, що не менше 75% геному здатне транскрибуватися, але більше половини цих фрагментів відносяться до некодуючих РНК. Вони діляться на дві великі групи: довгі (від 200 до 10 тис. рибонуклеотидів) і малі (менше 200), серед яких найкраще вивчений клас мікроРНК (miR). Вони виконують найважливіші регуляторні функції в житті нормальних клітин, а порушення в їх роботі виявлені при багатьох захворюваннях людини, в тому числі і онкологічних. Підтверджено, що мікроРНК не беруть участі в синтезі білків і кодуються спеціальними генами.

МікроРНК (зараз їх відомо понад 2000) — негативний регулятор експресії генів. Некодіючі однонітеві молекули мікроРНК (з 18-25 рібонуклеотидів) взаємодіють з комплементарними ділянками інформаційної РНК (іРНК), що призводить або до їх деградації, або перешкоджає трансляції в білки в рибосомах. Гени мікроРНК еволюційно консервативні і розподілені по всьому геному людини (у деяких ділянках вони утворюють специфічні кластери). Кодуючі ділянки геному р