Рослини-ГМО

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 70

Рослини-ГМО: як це робиться

• Рослини-ГМО: практичне застосування
• Рослини-ГМО: проекти в перспективі

Рослини-ГМО: як це робиться

«Потенціал. Хімія. Біологія. Медицина «№ 11, 2011

Напевно, кожен з вас чув про грізне важковиліковне захворювання — рак — яке може вражати багато органів у людини і тварин. І виникає питання: чи можуть рослини хворіти на ракові захворювання?

З попередньої статті ви дізналися про каллус — неорганізовано зростаючу масу рослинних клітин, яка часто виникає в природних умовах в місцях пошкодження («Потенціал», № 10, стр. 23).

Чи рослини хворіють на рак?

Зростання каллуса зовні нагадує зростання пухлин у тварин. Але на щастя для рослин, ділення клітин у них завжди залежить від двох гормонів: ауксинів і цитокінінів. Щоб зростання каллуса припинилося, достатньо скоротити надходження хоча б одного з них (клітини каллуса самі, як правило, не здатні утворювати ці речовини). Однак, як ви пам’ятаєте, багато шкідників і збудників хвороб рослин синтезують або ауксини, або цитокініни (в рідкісних випадках — і ті, і інші) для того, щоб контролювати зростання рослинних клітин. Тоді утворюються «відьоміни метли», галли та інші болючі розростання на тілі рослини. Але варто тільки тим чи іншим способом знищити збудника, болючий ріст відразу ж зупиниться. Таким чином, ні каллус, ні галли не є злоякісними раковими утвореннями.

Проте рослини хворіють на рак. Його викликають бактерії з сімейства Різобієві (Rhizobiacae), які належать до роду агробактерій (Agrobacterium). На місці інфекції утворюється маса клітин, що неорганізовано ділиться, схожа на каллус (рис. 1). Якщо агробактерії вбити за допомогою антибіотиків, то зростання пухлини як і раніше продовжиться. Виникає злоякісна пухлина, зростання якої рослину не може контролювати.

Ріс. 1. Корончастий галл — злоякісна пухлина, викликана агробактеріями (Agrobacterium tumefaciens) на гілці бузку. Зображення: «Потенціал. Хімія. Біологія. Медицина «

При аналізі вмісту гормонів в пухлині виявляється, що рівень і ауксинів, і цитокінів підвищено. Кожна клітина пухлини здатна самостійно виробляти ці гормони і більше не залежить від інших частин рослинного організму.

Агробактерії — природні «генні інженери»

Агробактерії вражають переважно двудольні рослини, серед яких найбільш помітні пухлини на деревах і чагарниках. Агробактерії викликають рак коріння винограду (збудник — A. vitis, агробактерія «виноградна»), коріння малини (A. rubi, агробактерія «малинна»), хворобу корончастого галла у широкого кола господарів (A. tumefaciens, агробактерія «пухлинна»). Незвичайне захворювання, що проявляється як утворення з маси коріння, густо покритих кореневими волосинами — хвороба «косматого» або «бородатого» кореня — також викликається агробактеріями (A. rhizogenes, агробактерія «коренеобразна»). Є серед агробактерій і порівняно «мирний» (непатогенний) вид — A. radiobacter (агробактерія «коренева»), який мешкає в тонкому шарі ґрунту, що оточує коріння рослин. A. radiobacter живиться кореневими виділеннями, але не завдає шкоди самим рослинам. Чим же викликані інфекційні властивості більшості видів агробактерій?

Генетичний матеріал бактерій складається з нуклеоїду (велика кільцева молекула ДНК, в якій зберігається «основна» генетична інформація), і плазмід (більш дрібних кільцевих молекул ДНК з меншою інформаційною ємністю). Властивість агробактерій вражати ті чи інші види рослин «запрограмовано» саме в плазмідах. Залежно від типу захворювання ці плазміди позначають як Ti-плазміди (від англ. tumor inducing — зухвалі) і Ri-плазміди (від англ. root inducing — що викликають [космате] коріння). При втраті плазмід агробактерії втрачають властивість викликати відповідні захворювання.

Плазміди мають цілий ряд цікавих і практично важливих властивостей. По-перше, в одній клітині агробактерії не можуть зустрітися не тільки Ti- і Ri-плазміди, але навіть дві різних Ti-плазміди! Якимось чином перша «поселилася» в бактерії плазміду не допускає проникнення і розмноження інших плазмід, схожих на неї.

По-друге, плазміди здатні передаватися від однієї бактеріальної клітини до іншої. Як це не парадоксально, в ґрунті тільки 1-5% клітин вільно живуть агробактерій «озброєні» Ti- або Ri-плазмідами. Але як тільки починається процес інфекції, плазміди активно розмножуються і передаються від бактерії до бактерії.

По-третє, Ti- і Ri-плазміди (порівняно з іншими плазмідами бактерій) мають великі розміри: близько 200-300 тис. пар підстав. Це не дозволяє за допомогою стандартних методик відокремити ДНК цих плазмід від ДНК нуклеоїду, що створює певні труднощі в роботі молекулярних біологів з плазмідами.

Які ж гени несуть в собі Ti-плазміди? Для зараження рослин найбільш важливим виявляється Vir-район (від англ. virulence — здатність вражати [рослини], патогенність), в якому закодовано досить багато генів. Постійно працюють тільки два гени: VirA и VirG. Білок VirA — це рецептор на особливу речовину фенольної природи — ацетосирингон. Ацетосирингон виділяється при пошкодженні клітин рослин. Білок VirA реагує на ацетосирингон і передає сигнал на білок VirG, який активує всі інші гени Vir-району. В результаті: 1) клітини агробактерій пливуть до місця ураження (орієнтуючись щодо збільшення концентрації ацетосирингона); 2) Ti-плазміду починає розмножуватися і передаватися іншим бактеріям того ж виду; 3) з’являються інші білки-продукти генів Vir-області (рис. 2).

Рис, 2. Функції деяких білків з Vir-району. Зображення: «Потенціал. Хімія. Біологія. Медицина «

Білок VirD1 спільно з білком VirD2 знаходять в Ti-плазміді певні ділянки, що складаються з 25 пар нуклеотидів, і розрізають їх, перекидаючи ковалентний зв’язок з кінця ДНК на білок VirD2. У Agrobacterium tumefaciens таких ділянок дві: вони обмежують так званий Т-район (від англ. transferred — переноситься). Один з ланцюгів ДНК відокремлюється і йде; таким чином, в Ti-плазміді виникає пролом. Спеціальна система репарації ДНК забудовує пролом новим ланцюгом ДНК, і з тієї ж Ti-плазміди можна ще раз вирізати Т-район, Ti-плазміду в цілому зберігається.

Одноланцюжкова Т-ДНК, пов’язана з білком VirD2, надалі «одягається» за допомогою білка VirE2, який не дає ферментним системам бактеріальної клітини зруйнувати одноланцюжкову Т-ДНК.

На поверхні клітини агробактерії за допомогою різноманітних білків VirB утворюється апарат для перенесення ДНК з однієї клітини в іншу. Саме білки VirB відповідають за переміщення комплексу VirD2 з одноланцюжковою ДНК з клітини агробактерії в клітку рослини. Білки VirE2 також переміщаються в клітку господаря.

Далі комплекс одноланцюжкової Т-ДНК з білками VirD2 і VirE2 проникає в ядро рослинної клітини. Білок VirD2 «надрізає» ДНК клітини-господаря і вбудовує Т-ДНК з Ti-плазміди. Таким чином, відбувається процес вбудовування чужорідної ДНК в ДНК клітини рослини. Після цього клітку рослини можна вважати генетично модифікованою. У процесі еволюції агробактерії «розробили» механізм отримання генетично модифікованих клітин рослини, тобто стали природними «генними інженерами».

Що міститься в Т-районі

Гени, які містяться в Т-районі, в самій клітці агробактерії не працюють, оскільки у них є тільки еукаріотичні промотори. Два з цих генів відповідають за біосинтез ауксинів: iaaH и iaaM. Ще один ген — iptZ — кодує ключовий фермент синтезу ізопентеніладеніну (одна з форм цитокінінів). Таким чином, потрапивши в геном рослини, Т-ДНК викликає синтез як ауксинів, так і цитокінінів (рис. 3). При цьому клітини рослини-господаря починають неорганізовано ділитися, утворюючи пухлину.

Рис, 3. Після вставки Т-району в клітці рослини-господаря починається неконтрольований синтез аукціонів, цитокінінів і опинів. Зображення: «Потенціал. Хімія. Біологія. Медицина «

Однак для того, щоб ділення клітин рослини приносило агробактеріям користь, необхідно, щоб вони синтезували щось корисне для агробактерій. Дійсно, до складу Т-району входять гени біосинтезу речовин, які утворюються з амінокислот і кето-сполук. Ці речовини отримали назву опинів. Ні самі рослини, ні інші організми, що мешкають на рослинах, не можуть розщепити опин. І тільки агробактерії здатні «перетравлювати» той опин, синтез якого вони викликали.

Опинів досить багато, і кожна Ti-плазміда забезпечує синтез свого опина (нопалина, агроцінопіна, вітопина, куркумопіна та ін.). У самій Ti-плазміді (але не в Т-районі!) є гени, що відповідають за «перетравлення» відповідного опина. Це пояснює, чому одна Ti-плазміда, захопивши клітку агробактерії, не пускає в неї іншу Ti-плазміду, що відповідає за синтез і метаболізм іншого опина.

Після впровадження ДНК з Т-району клітини пухлини інтенсивно діляться і продукують саме той опин, який здатна «перетравити» агробактерія, що викликала дану інфекцію. Якщо в ґрунті мешкають два різні види агробактерій, то при інфекції перша бактерія якимось чином не пускає іншу, яка харчується іншим опином.

На цьому заснований біологічний метод боротьби з агробактеріальним раком. Як ви знаєте, є непатогенні агробактерії. Вони також «не пускають» інші види агробактерій до кореневої системи рослини, через яку і відбувається поразка. Якщо наперед обробити рослину певними штаммами A. radiobacter, то рослина не захворіє ні корончастим галом, ні кореневим раком, ні хворобою бородатого кореня.

Дивно, але у деяких агробактерій у складі плазмід є не один, а два або навіть три Т-райони, кожен з яких «обрамлений» послідовностями з 25 нуклеотидів. У випадку A. rhizogenes ці ділянки називають T_L і T_R-районами, а у A. rubi є T_A, T_B і T_C відповідно. Найбільш дивно захворювання бородатого (косматого) кореня. У TR-районі містяться ті ж гени, що і у решти агробактерій. Вони відповідають за синтез аукціонів, цитокінінів і опин. У TL-районі містяться гени, що відповідають за те, щоб неактивні форми ауксинів переходили в активні. Виявляється, для успішної інфекції достатньо тільки TL-району! І тоді клітини пухлини активують «запасні» форми ауксинів самої рослини, а це призводить до ризогенезу, тобто до утворення численних придаткових коренів на місці пухлини.

Отже, в результаті перенесення Т-ДНК з Ti-плазміди в клітку рослини-господаря відбувається неконтрольоване утворення гормонів (ауксинів і цитокінінів), що призводить до злоякісного зростання клітин і подальшого синтезу азовмісних речовин — опин. До місця пухлини притікає все більше і більше амінокислот, але вони постійно «виводяться з обороту» рослини, т. к. перетворюються на нові порції опінів, які служать джерелом живлення для відповідного штаму агробактерій. «Позбутися» чужорідної ДНК рослинні клітини вже не можуть. Зростання клітин і синтез опінів тривають навіть у тому випадку, коли агробактерії з якихось причин загинули.

Отримання генетично модифікованих рослин за допомогою агробактерій

Виявляється, гени Vir-району переносять у клітку рослин будь-які послідовності ДНК, які укладені між двома 25-нуклеотидними повторами. Гени з Т-району все одно «не працюють» у клітинах агробактерій. Тому агробактерій можна «обдурити»: замість «нормальних» генів включити в Т-ДНК ті гени, які потрібні людині. Тоді вся система інфекції спрацює, але в рослину потраплять зовсім інші гени!

Тим не менш, при втіленні в життя такої, на перший погляд, простої ідеї виникли деякі складнощі. Головна з них — розміри Ti-плазмід, які не дозволяють виділяти їх з клітин агробактерій. Тоді вчені вирішили розділити Ti-плазміду на дві частини: в одній залишити Vir-район, а в іншій (тепер вже маленькій) — Т-район. Плазміду з Vir-районом називають «помічником» (або хелпером, від англ. help — допомагати).

Маленьку плазміду зі штучним Т-районом можна виділяти з клітин бактерій, «різати/клеїти» за допомогою спеціальних ферментів у пробірках, вставляючи потрібні гени в Т-район, а потім розмножувати в кишкових паличках (Escherichia coli) і переносити в агробактерії.

Щоб жодна з плазмід «не загубилася», кожну забезпечили генами стійкості до різних антибіотиків. Тепер, вирощуючи бактерії на середовищі з певною комбінацією антибіотиків, можна відбирати клітини, в які потрапила або одна з плазмід, або обидві.

Отже, завдання практичної роботи з Ti-плазмідою вирішене. Але як зрозуміти, чи відбулося перенесення ДНК з Т-району? Адже тепер у клітини не потрапляють гени біосинтезу ауксинів і цитокінінів, і пухлина утворитися не може.

Крім цікавого вчених гена (так званого гена інтересу) в Т-район обов’язково вставляють ген стійкості до якогось третього антибіотика, який діє на рослинні клітини. У середу крім поживних речовин додають ауксин і цитокінін, а також антибіотики в новому поєднанні: так, щоб агробактерії і рослинні клітини без вставленого Т-району загинули, а вижили б генетично модифіковані клітини. Як ви пам’ятаєте, аукціон і цитокінін потрібні для ділення рослинних клітин. У результаті повинна вирости каллусна маса з генетично модифікованих клітин. Отримати з неї нові рослини можна все тими ж методами біотехнології (див. «Потенціал» № 10).

Рис, 4. Репортерний ген глюкуронідази дозволяє по синій кольоровій реакції визначити, що рослина генетично модифікована. Фото з сайту www.phys.ufl.edu

На всіх етапах роботи добре б подивитися, в які саме клітини потрапила штучна Т-ДНК. Для цього в Т-район вводять ще один ген — репортерний. Основна вимога до нього — продукт гена не повинен зустрічатися в звичайних рослинних клітинах і повинен легко і швидко виявлятися. Як репортерні на сьогодні найчастіше використовують два гени: глюкуронідази (з бактерій) і зеленого флуоресуючого білка (з медузи). Глюкуронідаза дає колірну реакцію з синтетичною речовиною, при якій генетично модифіковані клітини фарбуються в темно-синій колір (рис. 4). Є тільки один недолік: клітини при такому фарбуванні гинуть. Зелений флуоресцентний білок світиться при освітленні світлом з певною довжиною хвилі, і клітини не гинуть (рис. 5).

Рис, 5. Зелений флуоресцентний білок як репортер дозволяє спостерігати за живими клітинами в рослинах. Фото з сайту www.genomenewsnetwork.org

І лише на останніх етапах перевіряють, чи працює ген інтересу (як правило, доводиться проводити численні аналізи на наявність певних послідовностей ДНК, РНК і на сам білковий продукт гена інтересу).

Таким чином, у будь-якій генетично модифікованій рослині крім гена інтересу є «баласт» або «генетичне сміття», представлене як мінімум геном-репортером і геном стійкості.

За допомогою різних хитрощів з геном інтересу можна отримати рослини, що містять новий білковий продукт, якого раніше в клітинах рослин не було. Або, навпаки, можна «вимкнути» якийсь власний ген рослини, «змусити» його працювати в інших органах і тканинах тощо. Це дозволяє вченим детально досліджувати роботу генома рослини. Але генетично модифіковані рослини мають практичне застосування.