SERS — вивчення цитохрому з у живих мітохондріях
|
Про автора
Евеліна Іллівна Нікельшпарг — аспірантка кафедри біофізики біологічного факультету Московського державного університету ім. М. В. Ломоносова. Область наукових інтересів — структура та функціонування мітохондрій, спектроскопія гігантського комбінаційного розсіювання, фотобіологія. Переможець конкурсу «Біо/мовляв/текст» 2015 р. в номінації «Своя робота». |
Жалюзі опущені. Вимкнено світло. Ми занурені у морок. Крапля каламутної рідини падає на срібну підкладку. Спалах зеленого світла. 30 секунд. Спектр. Так починається наш довгий робочий день. А тепер про все по порядку.
Крапля каламутної рідини — це суспензія мітохондрій, клітинних органелл розміром всього 1-2 мкм. Правда, органеллами вони стали не відразу: згідно теорії симбіогенезу, мітохондрії з’явилися в еукаріотичних клітинах як бактерії-симбіонти і за мільярди років обросли безліччю функцій.
У мітохондріях протікають складні біохімічні та біофізичні процеси. Основні з них: окислення поживних речовин і виробництво молекул АТФ — універсального джерела енергії для більшості біологічних процесів у клітинах. Крім того, мітохондрії беруть участь в ініціації апоптозу, старінні клітин, продукції активних форм кисню, метаболізмі ліків, виробленні тепла, запасають в собі іони кальцію, синтезують деякі гормони і т. д. [1].
Мітохондрії мають такий широкий спектр функцій, що порушення їхньої роботи може стати причиною безлічі хвороб: різних видів міопатій (атрофії м’язів), серцево-судинних захворювань, діабету та ін. [2]. Більшість з них пов’язані з мутаціями в генах, що кодують білки мітохондрій, але може бути і навпаки: деякі захворювання або неправильний спосіб життя (ожиріння, вживання наркотиків тощо) можуть призвести до порушення роботи мітохондрій. Механізми цих процесів хвилюють насамперед біологів, але і для фізиків мітохондрії представляють великий інтерес як перетворювачі енергії і фактично білковий електропровід [3].
Як все влаштовано
Мітохондрії складаються з двох мембран: зовнішньою, проникною для іонів і деяких білків, і внутрішньою, де знаходяться чотири білкових комплекси дихального ланцюга (або електрон-транспортного ланцюга, ЕТЦ) і АТФ-синтазу (рис. 1). Внутрішня мембрана утворює безліч складок, званих крістами (від лат. crista — гребінь), і обмежує внутрішній простір — матрикс, де містяться ферменти циклу трикарбонових кислот, або циклу Кребса. Також у мітохондріях є рухомі елементи комплексу дихального ланцюга: водорозчинний білок цитохром з і жиророзчинний убіхінон, також відомий як кофермент Q.
Ріс. 1. Комплекси дихального ланцюга, локалізовані у внутрішній мембрані мітохондрій. I — фермент НАДН-дегідрогеназа окисляє НАДН з передачею двох електронів на убіхінон (Q), при цьому з матриксу в міжмембранний простір надходить чотири протони; II — фермент сукцинатдегідрогеназа пов’язує кофактор ФАД і окисляє сукцинат до фумарату з відновленням Q; оскільки ця реакція дає менше енергії, ніж окислення НАДН, комплекс II не здійснює перенесення електронів; III — цитохром bc1-комплекс (тип цитохрому показано в сірих гуртках) каталізує дві реакції: окислення Q і відновлення цитохрому з, при цьому два протони, вивільнені QH2, йдуть у міжмембранний простір; IV — фермент цитохромоксидазу оксисляє цитохром з (зелені гуртки) і відновлює кисень (електрони переносяться на кисень, і протони перекачуються з матрикса в міжмембранний простір, при цьому кисень відновлюється до води), потім АТФ-синтазу використовує отриману енергію (протони) для синтезу АТФ з АДФ і неорганічного фосу. Чорними стрілками показаний транспорт електрону, пунктирною стрілкою — дифузія цитохрому з від комплексу III до IV, зеленими стрілками — перенесення протона
Принцип роботи дихального ланцюга — окислення субстратів, що надходять з циклу Кребса, і перенесення електронів від них за допомогою кофакторів ЕТЦ на кінцевий акцептор — кисень. Є певна закономірність у послідовності перенесення електронів: вони надходять від донора з більш негативним окислювально-відновлювальним потенціалом, або редокс-потенціалом (Ered/ox, від англ. reduction — відновлення, oxidation — окислення), до акцептора з більш позитивним Ered/ox. Таким чином, електрон ніби рухається вниз за течією, визначеною Ered/ox переносників електрону. Під час перенесення електронів деякі комплекси дихального ланцюга закачують протони з матрикса в міжмембранний простір, тим самим створюючи електрохімічний потенціал на внутрішній мембрані мітохондрій, який використовується для синтезу АТФ (див. рис. 1) [1].
Зауважу, що мітохондрії — дуже популярний об’єкт дослідження. Їх вивчали такі корифеї науки, як Х. А. Кребс, П. Д. Мітчелл, А. Л. Ленінджер, Б. Чанс, В. П. Скулачов і багато інших, і завдяки їм відомо про ці органелли вже чимало, але ще не все. Багато мітохондріальних процесів і властивостей переносників електронів досі не вивчені, що пов’язано в першу чергу з відсутністю відповідних неінвазивних методик. Минулого року ми, співробітники лабораторії біофізики клітини біофаку МДУ ім. М. В. Ломоносова, разом з колегами, які працюють на інших факультетах нашого університету і в Інституті загальної та неорганічної хімії ім. Н. С. Курнакова РАН, а також з науковцями з Німеччини та Данії створили методику для селективного дослідження конформації гему цитохрому з безпосередньо в живих мітохондріях [4]. Що ж таке конформація гема і чому вона важлива?
Редокс-потенціал і конформація гему
Якщо придивитися до комплексів дихального ланцюга, локалізованих у внутрішній мембрані мітохондрій, то в трьох з них можна побачити цитохроми — гемовмісні білки, які служать кофакторами, що беруть участь у перенесенні електронів, і ще один, який дифундує в міжмембранному просторі (див. рис. 1). Всього в мітохондріях є три типи цитохромів — а, b і с. Вони дуже схожі, відрізняються лише бічними радикалами (рис. 2).
Рис, 2. Геми цитохромів різних типів. Кожен гем складається з чотирьох п «ятичних азотовмісних циклів (порфіринів), пов» язаних між собою [1]. Атоми азоту координують атом заліза (Fe). Геми відрізняються бічними групами, і тільки гем типу з пов’язаний з білком ковалентно
Під час перенесення електрона змінюється редокс-стан атома заліза (Fe3 +/Fe2 +), який розташовується в гемі цитохромів, що призводить до зміни його конформації. Ці два параметри (Ered/ox і конформація гема) завжди пов’язані один з одним. Конформація гема цитохромів також залежить від білкового середовища [5, 6]. А оскільки Ered/ox визначає ефективність перенесення електрону, то конформація гема — річ важлива. Крім того, щоб відбулося перенесення електрона з одного цитохрому на інший, потрібно, щоб їхні геми знаходилися на певній відстані один від одного і були правильно орієнтовані. Тому будь — які зміни в цитохромах можуть відбиватися на ефективності перенесення електрону, тобто на роботі всього дихального ланцюга і, як наслідок, енергозабезпеченні клітин [7, 8].
Найбільш цікавий у цьому відношенні цитохром с. Оскільки це єдиний мобільний переносник електронів, що курсує в міжмембранному просторі (всі інші цитохроми заякорені в комплексах ЕТЦ), він найбільш схильний до змін, які можуть відбуватися в мітохондріях. Крім цього вихід цитохрому з запускає каскад реакцій, що ведуть до апоптозу, і в цьому процесі теж важливий його редокс-потенціал [9].
Виникає питання, як оцінити Ered/ox і зрозуміти, в якій конформації і в якому редокс-стані знаходиться гем цитохрому з в мітохондріях?
Чисельно визначити Ered/ox можна за допомогою електрохімічних методів. Однак для цього потрібні комплекси ЕТЦ ізолюють і поміщають в зовсім інші умови середовища, що може саме по собі змінити їх властивості. Завдяки таким потужним методам, як ядерно-магнітний резонанс і рентгеноструктурний аналіз, ми знаємо, в якій конформації знаходяться білки і кофактори дихального ланцюга в окисленій і відновленій формі. Але нас цікавить їх стан в максимально природних умовах, а також співвідношення цих станів при роботі дихального ланцюга.
Існує кілька неінвазивних методів для визначення окислювально-відновлювального стану цитохромів. Наприклад, абсорбційна спектроскопія, заснована на використанні здатності речовини до виборчого поглинання світлової енергії. Спектр поглинання мітохондрій включає спектр всіх наявних цитохромів у мітохондріях, а також небілкового компонента — ФАД, який входить до складу ферменту сукцинатдегідрогенази (II компонент дихального ланцюга, див. рис. 1). Але через те, що всі типи цитохромів дуже схожі і, відповідно, володіють схожими спектрами поглинання, а їх окислювально-відновлювальний стан весь час змінюється при нормальній роботі дихального ланцюга, складно оцінити внесок різних цитохромів у спектр [10].
За спектрами флуоресценції НАДН і ФАД + можна приблизно оцінити редокс-стан тільки I і II комплексів дихального ланцюга. А за потенціалом на внутрішній мембрані мітохондрій можна судити тільки про роботу мітохондрії загалом [11].
Безпосередньо отримання інформації про конформацію та редокс-стан цитохрому з цілого і функціонуючого (інтактного) мітохондрії — це вкрай складне завдання, адже його конформація постійно змінюється при роботі дихального ланцюга, він дифундує і взаємодіє з мембранними комплексами. Наявність методу, який дозволяв би це зробити, значно полегшила б завдання і розширила знання про вплив цитохрому з на активність ЕТЦ і його внесок у розвиток мітохондріальних патологій.
Нові можливості старого методу
Рис, 3. Розсіювання світла на молекулі, пристрій спектрів комбінаційного розсіювання світла (КР) і схема переходів між коливальними подурівнями та електронними рівнями молекули. Спектри КР представляють залежність інтенсивності сигналу від частотного зрушення, ^. [см.. 1], а не від довжини хвилі. У цьому випадку спектри не залежать від вибору лазера і їх можна порівнювати. S0 і S1 — основний і перший збуджений електронні рівні зі структурою коливальних подурівнів. Сірою пунктирною лінією позначено віртуальний подуровень (у разі, коли енергії кванта не вистачає для переходу на існуючий подуровень). 1 — поглинання кванту інфрачервоного (ВК) випромінювання призводить до переходу молекули на новий коливальний подуровень; 2 — стоксово КР спостерігається, коли молекула знаходиться в невіднятому стані і при взаємодії зі світлом переходить на більш високий коливальний подуровень, при цьому енергія розсіяного світла менше енергії збуджувального світла (зелений — помаранчевий); 3 — релєєвське розсіювання, що не призводить до зміни енергії (і, відповідно, довжини хвилі) збуджуючого світла; 4 — антистоксово КР спостерігається в разі, якщо молекула знаходиться в збудженому стані і при взаємодії зі світлом переходить на нижній коливальний подуровень, при цьому енергія розсіяного світла буде більше енергії збуджуючого світла (зелений — синій); 5 — флуоресценція: квант світла викликає електронно-коливальний перехід, після чого спостерігається релаксація (бордова фігурна стрілка) і випускання світла з меншою енергією (синій — червоний)
Історично в нашій лабораторії для вивчення конформаційних станів різних біологічних молекул використовують метод комбінаційного розсіювання світла (КР). Це явище ґрунтується на ефекті неупругого (раманівського, або комбінаційного *) розсіювання оптичного випромінювання на молекулах речовини. При звичайному (упругому, або релєєвському) розсіянні частота (і довжина хвилі) випромінювання не змінюється, а при несправжньому — змінюється. Це виражається у появі додаткових ліній (ліній КР) на спектрі розсіювання (рис. 3). Яку ж інформацію він несе?
Під «взаємодією» світла з молекулою мається на увазі енергетичний обмін між фотонами і коливальними подурівнями енергії молекули. Це означає, що спектр КР несе в собі інформацію про коливання атомів в молекулах досліджуваної речовини. Строго кажучи, різність частот збуджувального і розсіяного світла ( ) характеризує нормальні частоти коливань молекули в цілому. Більшість піків на спектрі КР обумовлено коливаннями відразу декількох хімічних зв’язків в молекулі, але деякі піки описують коливання певних груп атомів (рис. 4) [12, 13]. За допомогою таких ключових коливань можна визначити, з чим ми маємо справу — з ліпідами, білками, ДНК, порфіринами або іншими молекулами. І для кожної молекули буде свій неповторний спектр КР — щось на зразок «відбитків пальців» молекули. І так само, як за відбитками пальців можна розрізнити близнюків, за спектрами КР можна відрізнити схожі за будівлею молекули. Тому метод надзвичайно популярний серед хіміків-аналітиків і фізиків, а також застосовується в археології, екології, геології і навіть у криміналістиці.
Перші біологічні експерименти з використанням методу КР велися ще в 1935 р. на амінокислотах. Однак, повторюся, роботи на ізольованих молекулах не настільки цікаві для біологів, а для роботи на цілих клітинах сигнал КР має низьку інтенсивність (і це один з істотних недоліків методу), тому метод не отримав широкого поширення. І тільки в 1990 р., після суміщення КР-спектрометра з конфокальним мікроскопом, з’явилася можливість реєструвати КР цілих клітин або окремих їх ділянок. В останні роки метод нарешті набув популярності, притому заслуженої, оскільки КР-спектроскопія має суттєві переваги перед іншими методами, і головне, дозволяє отримувати ексклюзивну інформацію.
Основна перевага КР-спектроскопії — неінвазивність, тобто за допомогою цього методу можна вивчати біохімічний склад клітин, не руйнуючи їх. Крім того, не потрібно використовувати мітки або зонди, як для флуоресцентної мікроскопії. Це означає, що можна вивчати систему (в нашому випадку клітку) в природних умовах, а це вкрай важливо, враховуючи, що багато з існуючих міток (як флуоресцентних, так і ізотопних) токсичні. До того ж зникає проблема вицвітання міток і з’являється можливість досліджувати невеликі молекули, до яких важко «пришити» мітку. Важливо також, що метод КР дозволяє працювати з водними розчинами, в тому числі з фізіологічними буферами, на відміну від ВК-спектроскопії, оскільки вода сильно поглинає в ВК-області.
Рис, 4. Гем типу b, який міститься в гемоглобіні еритроцитів, і його спектр КР [13]. Різні групи атомів і відповідні їм піки позначені одним кольором
Що стосується ексклюзивної інформації, то це в першу чергу інформація про конформацію досліджуваних молекул і мікроокруження функціональних груп. А від цих параметрів може залежати і активність молекул у клітці, і взаємодія з іншими молекулами, тобто те, що впливає на роботу цілої клітини. Дослідити конформацію молекул — це складне експериментальне завдання. Для її вирішення можна використовувати ВК-спектроскопію, але знову ж таки тільки на висушених зразках. Можна застосовувати більш складні і дорогі технології, такі як рентгеноструктурний аналіз і ЯМР. Ці методи дозволяють отримувати цілісну картину розташування атомів в молекулі, але очевидно, їх поки не можна використовувати для вивчення молекул в живій клітці. А КР-спектроскопію можна: залежно від того, в якій конформації знаходиться молекула, атоми будуть коливатися по-різному, що відіб’ється на спектрах.
До мітохондрій від чистого серця
Про неінвазивний метод дослідження цитохромів мітохондрій у клітинах співробітники нашої лабораторії задумувалися вже кілька років тому, коли досліджували вплив окислювального стресу на клітини серцевого м’яза (кардіоміоцити) методом комбінаційного розсіювання світла [14]. Тоді вдалося з’ясувати, що спектри КР різних типів цитохромів і міоглобіну (який, як і гемоглобін, містить гем типу b) можна розрізняти за спектрами КР інтактних клітин і навіть визначати їх окислювально-відновлювальний стан. Пізніше Браже з іншими співробітниками успішно провела подібне дослідження на цілому серці, тобто in situ (рис. 5) [15].
Рис, 5. Реєстрація спектра КР цілого серця [15]
Однак у цитохромів є одна особливість — тільки для відновлених їх форм спектр КР інтенсивний. Якщо орієнтуватися тільки на цей критерій, можна втратити важливу інформацію про зміни в досліджуваній системі, адже інтенсивність залежить і від кількості молекул, і від вираженості тих чи інших коливань, і від інших параметрів. До того ж для визначення точного положення піків більшість дослідників, які мають справу з цитохромами, змушені штучно відновлювати зразки, що свідомо порушує їхню нативність.
Частково проблему вирішили японські вчені. Вони визначили, які піки на спектрі КР характерні тільки для відновлених цитохромів, а які — тільки для окислених [16]. Однак проблема інтенсивності спектрів як і раніше зберігалася, і потрібно було її вирішувати.
Один із способів посилити сигнал КР — це помістити досліджувану молекулу поблизу наночастинки благородного металу, наприклад золота або срібла. Ці метали мають вільні поверхневі електрони. Квант їхніх колективних коливань називається плазмоном. Якщо частота падаючого світла входить у резонанс з частотою коливань поверхневих електронів металу, то виникає ефект плазмонного резонансу, який призводить до багаторазового посилення електромагнітного випромінювання поблизу наночастинки. Цей ефект використовують у методі поверхневого плазмонного резонансу (surface plasmon resonance, SPR), в абсорбційній і флуоресцентній спектроскопії. Але нам потрібен був спосіб, що дозволяє посилити саме КР-сигнал. І для цього існує спектроскопія гігантського комбінаційного розсіювання (SERS, англ. surface enhanced Raman spectroscopy).
Спектри КР і SERS цитохрому добре відомі [17, 18]. І що найпрекрасніше, спектри SERS окисленого і відновленого цитохрому практично не відрізняються за інтенсивністю. Так чому б не зареєструвати спектр SERS мітохондрій?
Ідея прийшла від професора Копенгагенського університету О. В. Сосновцевої, з якою наша лабораторія співпрацює не перший рік. На той момент було тільки дві роботи з вивчення мітохондрій методом SERS і його різновидом TERS (Tip-enhanced Raman spectroscopy). У першій роботі дослідники реєстрували спектр SERS тільки від білків і ліпідів мітохондрій, але не від цитохромів, а в другій роботі — використовували не нативні, а висушені мітохондрії [19, 20].
Але як застосувати метод SERS для вивчення цитохромів живих мітохондрій? Перш ніж відповісти на це питання, перемістимося в недалеке минуле.
Міждисциплінарність — запорука успіху
У 2010 р., коли виник інтерес до нанотехнологій, академік Ю. Д. Третьяков (у той час декан факультету наук про матеріали МДУ) ініціював міжфакультетську співпрацю з біологами для проведення спільних досліджень методом SERS. Так почалася спільна робота нашої лабораторії під керівництвом Г.В. Максимова з групою хіміків-матеріалознавців на чолі з Є.А. Гуділіним.
Справа в тому, що SERS — метод непростий і вимагає виключно міждисциплінарного підходу. Кожен біологічний об’єкт унікальний, і щоб реєструвати від нього сигнал SERS, потрібно розробляти особливі наноструктури, які посилювали б сигнал від потрібного об’єкта, при цьому не пошкоджували його і витримували «атаку» фізіологічних багатокомпонентних буферів.
Більшість робіт, пов «язаних з SERS, передбачають адсорбцію молекул на поверхні наноструктур, нехай навіть введених всередину клітини [21]. Це пов’язано з тим, що посилення сигналу КР спостерігається тільки на дуже невеликій відстані від поверхні металу [22]. Однак такий підхід не завжди задовольняє запитів біологів. В ідеалі посилення сигналу має поширюватися на досить велику відстань (тільки так можна працювати з цілими клітинами і органелами, не пошкоджуючи їх), і бажано не вводити нічого всередину. Для цієї мети потрібно було розробити специфічний дизайн наноструктур і придумати методи їх синтезу, чим і зайнялася група Гуділіна.
Нарешті тривалі і наполегливі спроби розробити такі структури для дослідження живих клітин увінчалися успіхом. У 2012 р. дебютували наноструктуровані підкладки для посилення сигналу від примембранного гемоглобіну в інтактних еритроцитах [13]. За рахунок певної морфології наноструктур вдалося отримати посилення сигналу на відстані більше 10 нм, тобто більше товщини мембрани еритроциту.
Раз це вдалося зробити для еритроцитів, то можна зробити і для мітохондрій!
Довгоочікуваний спектр SERS мітохондрій
Жалюзі опущені. Вимкнено світло. Кімната занурена у морок. Крапля суспензії падає на срібну підкладку. Спалах зеленого світла, 30 секунд. Спектр. Той самий довгоочікуваний спектр SERS від ізольованих серцевих мітохондрій був отриманий! Залишалося тільки зрозуміти, від яких саме структур у мітохондріях виходить сигнал.
Рис. 6. Схема експерименту на ізольованих серцевих мітохонд
- Попередня
- Наступна