«Вчені з’ясували, чому бактеріофагам важко боротися з імунною системою бактерій»

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 60

Ріс. 1. Нескінченна гонка озброєнь між паразитами-бактеріофагами та їхніми жертвами-бактеріями лежить в основі швидкої еволюції тих та інших. Зображення з сайту discovermagazine.com

Система спадкованого набутого імунітету CRISPR-Cas, широко поширена у прокаріот, надійно захищає своїх власників від вірусів. Однак віруси, постійно мутуючи, здатні швидко (іноді менш, ніж за добу) долати імунітет будь-якої окремо взятої жертви. Як з’ясувалося, ефективність системи CRISPR забезпечується тим, що завдяки її роботі різні бактерії вчаться розпізнавати вірус по різних ділянках його геному. В результаті способи захисту бактерій від даного вірусу стають настільки різноманітними, що ніякі точкові мутації вже не допомагають вірусам ефективно пристосуватися до колективної оборони жертв. Це, в свою чергу, сприяє еволюції спеціальних вірусних генів, що переважають роботу системи CRISPR в цілому, а бактерії відповідають на це еволюцією нових варіантів системи CRISPR — але такі зміни потребують більшого часу.

Робота системи CRISPR-Cas заснована на тому, що невеликий фрагмент, вирізаний з іноземнородної бактеріальної клітини (наприклад, вірусної) ДНК, вставляється в спеціальну ділянку (локус CRISPR) геному бактерії. Кожен локус CRISPR містить безліч таких вставок («спейсерів»), що є шматочками спадкового матеріалу паразитів (вірусів, плазмід, мобільних елементів). На основі спейсерів синтезуються молекули РНК, комплементарні ділянці геному паразиту. Ці РНК в комплексі з білками Cas використовуються потім для впізнання і знешкодження чужорідної ДНК з такою ж послідовністю нуклеотидів. Таким чином, якщо в клітку одного разу проникла вірусна ДНК, але клітина примудрилася вижити і вбудувала шматочок вірусного геному в свою хромосому, то подальші спроби таких же вірусів заразити цю клітку або її нащадків будуть припинятися швидко і ефективно (більш докладну розповідь про систему CRISPR читач знайде за посиланнями, наведеними наприкінці новини).

Втім, віруси не схильні довго залишатися «такими ж». За рахунок випадкових мутацій і відбору вони вміють обходити імунний захист жертв. Щоб даний спейсер втратив свою ефективність, достатньо, щоб комплементарний йому фрагмент вірусного геному хоча б трохи змінився. Тому віруси успішно і часом дуже швидко долають придбаний імунітет бактерій за рахунок точкових мутацій. З іншого боку, системи CRISPR дуже широко поширені біля прокаріот і, мабуть, забезпечують своїм власникам надійний захист. Що ж дозволяє цим системам на рівних змагатися з швидко еволюціонуючими паразитами?

Генетики і мікробіологи з Великобританії, Франції і США припустили, що важливий внесок в ефективність CRISPR робить ту обставину, що у відповідь на одну і ту ж вірусну інфекцію навіть генетично ідентичні бактеріальні клітини вставляють у свій геном різні спейсери, що відповідають різним ділянкам генома вірусу. У результаті популяція жертв швидко набуває генетичного розмаїття, що сильно ускладнює еволюційне завдання, що стоїть перед вірусами. Придбавши точкову мутацію, що захищає від одного спейсера, віруси зможуть заразити тільки невелику частину популяції жертв. На щастя для бактерій, бактеріофаг не може визначити заздалегідь, які спейсери є у даної клітини: це стане ясно, тільки коли він впорсне в неї свою ДНК, а тоді вже буде пізно передумувати. Тому більшість фагів у поліморфній популяції жертв приречена на загибель, навіть якщо у фагів то й справа з’являються точкові мутації, що захищають від того чи іншого спейсера. Щоб захиститися відразу від багатьох різних спейсерів, фагу потрібно одночасно придбати цілий комплекс необхідних точкових мутацій, що вкрай малоймовірно, адже мутації випадкові.

Перевірка цих припущень проводилася на бактеріях синьогнійної палички (Pseudomonas aeruginosa) і фагах DMS3vir. Для початку автори переконалися, що система CRISPR дійсно надійно захищає бактерій від цього різновиду фагів. У популяціях «диких» бактерій внесені дослідниками фаги повністю вимерли всього за 5 днів. У культурах бактерій з відключеною системою CRISPR віруси почувалися вільніше: за 30 днів, поки тривав експеримент, віруси не вимерли в жодній з ліній. У першому випадку всі бактерії, як і слід було очікувати, виробили спадкований придбаний імунітет на основі CRISPR. Бактерії з відключеною системою CRISPR теж виробили якийсь захист, але на іншій основі: у них поширилися мутації, що змінюють поверхневий білковий рецептор, за який чіпляється фаг, щоб заразити клітку. Мабуть, другий спосіб виявився менш ефективним і не дозволив популяціям повністю позбутися паразита, як це зробили популяції з працюючою системою CRISPR.

Автори підкреслюють, що повне вимирання вірусів у популяціях дикого типу є несподіваним результатом, оскільки відомо, що віруси в принципі вміють обходити CRISPR-імунітет за допомогою точкових мутацій. Може бути, вся справа в різноманітності спейсерів, що сформувалися у бактерій всередині кожної з піддослідних популяцій? Те, що спейсери дійсно виходять різні, було показано в колишніх експериментах. Тепер потрібно було довести, що ця різноманітність робить внесок в ефективність колективного імунного захисту. Для цього необхідно порівняти стійкість до вірусів у популяцій з різним рівнем різноманітності спейсерів.

Щоб отримати такі популяції, автори взяли свої піддослідні лінії, які перемогли вірусів за допомогою CRISPR, і виділили з них 48 індивідуальних клонів (тобто взяли 48 індивідуальних клітин і отримали від кожної численне потомство). Вчені очікували (і ці очікування згодом підтвердилися), що спейсери у всіх або майже всіх клонів виявляться різними. Потім з цих клонів були складені популяції п’яти типів, що розрізняються за рівнем генетичної різноманітності: популяції з одного клону (монокультури) і змішані популяції, складені з 6, 12, 24 і 48 клонів.

Ці популяції потім піддавалися зараженню вірусами. Цього разу вчених цікавила в першу чергу еволюція вірусів, а саме їх здатність долати імунний захист жертв. Тому спостереження тривали всього 3 дні — час, достатній для помітних еволюційних змін у вірусів, але недостатній, щоб піддослідні популяції бактерій встигли, створюючи нові спейсери, вирівнятися за рівнем генетичної різноманітності.

Результати підтвердили очікування авторів. За три доби віруси повністю вимерли у всіх популяціях жертв, складених з 24 і 48 клонів, і в багатьох популяціях, складених з 12 клонів. У найменш різноманітних популяціях, складених з одного або шести клонів, віруси в більшості випадків вціліли.

Кожні кілька годин протягом цього триденного експерименту частина вірусів вилучалася для детального аналізу. Фагів піддавали повногеномному секвенуванню, а також впроваджували в чисті культури кожного з 48 клонів бактерій, щоб подивитися, в яких випадках віруси навчилися долати імунний захист жертв.

Виявилося, що у тих вірусів, які три дні еволюціонували в монокультурах бактерій, у більшості випадків закріпилися мутації, що роблять відповідний спейсер неефективним. Причому відбувалося це, як правило, вже в першу добу. Тільки з п’ятьма з 48 монокультур вірусам не вдалося впоратися. Як з’ясувалося, в трьох випадках з цих п’яти у бактерій сформувалося не по одному, а по два або більше противірусних спейсерів.

У вірусів, які еволюціонували в бактеріальних популяціях, складених з 6 і 12 клонів, стійкість до тих чи інших спейсерів сформувалася лише в небагатьох випадках. Ну а ті бідолахи, яким довелося еволюціонувати в найбільш різноманітних популяціях жертв, складених з 24 і 48 клонів, не навчилися долати захист жодного з вихідних клонів (рис. 2).

Ріс. 2. Генетичне розмаїття жертв заважає вірусам долати їх імунний захист. Малюнок показує результати експериментів із зараження вірусами, які коеволюціонували з різними популяціями бактерій, кожного з 48 вихідних бактеріальних клонів. Кожна з п’яти колонок відповідає серії експериментів з одним з п’яти рівнів різноманітності жертв (зліва направо: 1 клон, 6, 12, 24, 48 клонів). У кожному експерименті вірусів для аналізу брали через 0, 16, 24, 40, 48, 64 і 72 години після зараження (6 вертикальних рядів всередині кожної колонки; внизу підписано час в добі після зараження — d.p.i.). Кожну порцію отриманих таким чином вірусів впроваджували в чисту культуру кожного з 48 клонів бактерій і дивилися, чи зможуть віруси розмножитися (червоні квадратики) або вимруть (зелені квадратики). Товстими чорними горизонтальними лініями розділені повторності, тобто різні піддослідні популяції з даним рівнем різноманітності. Малюнок показує, що в монокультурах бактерій віруси в більшості випадків менше, ніж за добу, навчилися долати імунний захист; в популяціях з 6 і 12 клонів це відбувалося рідко, в популяціях з 24 і 48 клонів — ніколи. Малюнок з обговорюваної статті в Nature

Причина, звичайно, не в тому, що у цих вірусів «правильні» мутації виникали зі зниженою частотою. Мутагенез, швидше за все, протікав однаково у всіх вірусів. Просто в монокультурі одинична мутація, що забезпечує захист від даного спейсера, відразу дає вірусу величезну перевагу (оскільки дозволяє заразити будь-яку бактерію), а в поліморфній культурі з 48 клонів точно така ж мутація забезпечить вірусу-мутанту успіх лише з ймовірністю 1/48. Навіть якщо йому несказанно пощастить, і він впорсне свою ДНК саме в таку бактерію, від чийого спейсера він тепер захищений, його нащадки знову зіткнуться з тією ж проблемою. І вона буде тільки посилюватися по мірі зниження чисельності бактеріального клону, що став вразливим. Втім, до цього справа зазвичай навіть не доходить: відбір практично не підтримує у вірусів точкові мутації, що захищають від окремих спейсерів, і віруси вимирають, так і не встигнувши подолати захист жодного з 48 клонів.

Ці висновки підтверджуються тим, що число мутацій, виявлених у геномах вірусів, які еволюціонували в монокультурах жертв, виявилося істотно вищим, ніж у вірусів, що еволюціонували в змішаних культурах: у першому випадку відбір підтримував у вірусів корисні мутації, а в другому ні. Крім того, виявилося, що бактерії зі змішаних культур за три доби не придбали нових противірусних спейсерів, тоді як в монокультурах такі спейсери з’явилися. Це теж логічно: у змішаних культурах небезпечні для бактерій віруси так і не з’явилися, а в монокультурах виникли віруси, що пробивають старий захист, і система CRISPR створила додаткові спейсери.

Таким чином, різноманітність спейсерів, породжуване системою CRISPR, дійсно робить важливий внесок у її ефективність. Якби на кожну інфекцію система відповідала створенням одного і того ж спейсера у всіх бактерій, віруси легко впоралися б з таким імунітетом. Але оскільки спейсери щоразу виходять різні, точкові мутації і відбір стають для вірусів недостатньо ефективною еволюційною стратегією.

Це пояснює ефективність системи CRISPR і її широке поширення у прокаріот. Залишилося зрозуміти, чому бактеріофаги досі не вимерли, якщо ця система така хороша. Відповідь на це питання частково вже відома: нещодавно у фагів були виявлені особливі гени, що переважають систему CRISPR як таку (див.: J. Bondy-Denomy et al., 2013. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system). У зв’язку з цим виникає наступне питання: якщо існують вірусні гени, які повністю виводять з ладу CRISPR, то чому всі віруси ними не обзавелися? І що бактерії можуть цим генам протиставити? Втім, відповідь на це питання теж вже частково відома: існує багато різних варіантів системи CRISPR, кожен з яких вразливий тільки для деяких варіантів генів анти-CRISPR і захищений від інших. А містити в своєму геномі купу додаткових генів — дороге задоволення для вірусів, у яких відбір зазвичай підтримує компактизацію геному (це підвищує швидкість розмноження вірусу).

Мабуть, антагоністична коеволюція (гонка озброєнь) між фагами і бактеріями йде паралельно на різних рівнях і в різних часових масштабах. Формування нових спейсерів і вироблення вірусами точкових мутацій, що роблять даний спейсер неефективним, займає всього кілька днів або навіть годин. Вироблення нових генів анти-CRISPR або нових варіантів системи CRISPR, невразливих для цих генів, можливо, вимагає тисяч і мільйонів років (хоча в світі вірусів і мікробів все, що було кимось колись винайдено, може потім швидко передаватися з рук в руки шляхом горизонтального перенесення). Кінця цій гонці не передбачається, і навряд чи хтось вийде з неї «остаточним переможцем». Однак знання її механізмів дозволить людям у майбутньому хоча б частково взяти її під свій контроль.

Джерело: Stineke van Houte, Alice K. E. Ekroth, Jenny M. Broniewski, Hélène Chabas, Ben Ashby, Joseph Bondy-Denomy, Sylvain Gandon, Mike Boots, Steve Paterson, Angus Buckling & Edze R. Westra. The diversity-generating benefits of a prokaryotic adaptive immune system // Nature. 2016. DOI: 10.1038/nature17436.

Див. також про CRISPR:

1) Бактерії успадковують придбаний імунітет, «Елементи», 21.01.2010.

2) Придбаний імунітет у бактерій може бути пов’язаний з механізмами РНК-інтерференції, «Елементи», 6.04.2011.

3) Прокаріотична система імунітету допоможе редагувати геном, «Елементи», 12.03.2013.

Про коеволюцію паразитів і господарів:

1) З паразитами не обов’язково боротися, до них можна пристосовуватися, «Елементи», 7.11.2007.

2) Сучасні паразити небезпечніші за минулі і майбутні, «Елементи», 12.12.2007.

3) Мурахи намагаються не пахнути як гусениці, що пахнуть як мурахи, «Елементи», 10.01.2008.

4) Амеби-мутанти не дозволяють себе обманювати, «Елементи», 6.10.2009.

5) Коловратки рятуються від паразитів, перелітаючи в інші водойми, «Елементи», 2.02.2010.

6) Гонка озброєнь — двигун еволюції, «Елементи», 1.03.2010.

7) Бактеріальна інфекція призводить до незворотної втрати статевого розмноження, «Елементи», 9.09.2010.

8) Різноманітність тропічних комах підтримується завдяки вузькій спеціалізації паразитів, «Елементи», 18.03.2014.

9) Різна стратегія захисту призводить до різного еволюційного відгуку, «Елементи», 10.06.2015.

Олександр Марков