Вирощений в лабораторії зачаток печінки перетворився на організмі миші на функціонуючий орган

Навчання 02 серпня 2022 Перегляди: 68

Ріс. 1. Схема експерименту. З плюрипотентних клітин людини (iPSC) отримували клітини ентодерми печінки (iPSC-HE, клітини ентодерми печінки — попередники зрілих клітин печінки). Ці клітини культивували на чашці Петрі разом з мезенхімними клітинами (MSC) і клітинами ендотелію судин (HUVEC). Після формування компактного зачатка печінки його пересаджували імунодефіцитним мишам і досліджували функціонування трансплантату. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Японським дослідникам вдалося створити трансплантат печінки незвичним методом: вони не стали вирощувати штучний орган поза організмом цілком, а отримали в лабораторії лише його зачаток, що нагадує ембріональний. Через дві доби після вживлення такого зачатка печінки в організм піддослідної тварини трансплантат приростав до кровоносних судин господаря і починав функціонувати і розвиватися. При штучному запуску гепатиту трансплантат допомагав піддослідній тварині вижити, беручи на себе функції її печінки.

Отримання штучних органів з індукованих плюрипотентних клітин — область досліджень, що стрімко прогресує прямо у нас на очах. Деякий час тому на «Елементах» ми розповідали про створення штучних кісток (див.: Кісткові трансплантати можна отримувати з перепрограмованих людських клітин, 11.07.2013); для цього клітини — попередники кісткової тканини вирощувалися на спеціальній основі, отриманій з кістки теля після видалення його клітин. А нещодавно в журналі Nature Communications з’явилася стаття про отримання штучного серця, по суті справи, тим же методом — культивуванням людських клітин на каркасі, отриманому з серця миші, з якого були видалені всі мишачі клітини (див.: Tung-Ying Lu et al., 2013. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells).

Крім того, методом вирощування штучних органів поза організмом реципієнта була знайдена цікава альтернатива: виявляється, в лабораторії достатньо отримати лише зачаток майбутнього органу, який при вживленні в організм майбутнього господаря розвинеться в повноцінний орган з необхідними характеристиками. Ефективність такого підходу продемонструвала група японських дослідників, отримавши трансплантати людської печінки з вирощених в лабораторії невеликих зачатків, що нагадують ембріональні.

Такі зачатки влаштовані незрівнянно простіше, ніж зрілі органи, тому для їх вирощування не потрібні складні біореактори і структурні основи анатомічної форми. Для отримання зачатка печінки необхідно мати лише клітини декількох типів: клітини судин, мезенхімні стовбурові клітини, а також клітини ентодерми печінки, що відповідають тим клітинам кишки зародка, які випинаються від неї, утворюючи зачаток майбутньої печінки. Останні клітини отримували з індукованих плюрипотентних клітин людини, перетворюючи їх спочатку на клітини ентодерми (клітини первинної кишки зародка), а потім на клітини ентодерми печінки, в яких вже працюють деякі характерні для клітин зрілої печінки гени (рис. 1). При правильному кількісному співвідношенні цих типів клітин, а також при культивації їх на відповідній підкладці створюються умови, що нагадують ті, в яких формується зачаток печінки ембріона. При цьому клітини, що ростуть на звичайній чашці Петрі, формують компактну структуру, яку можна успішно пересадити в організм-реципієнт (див. рис. 2, рис. 3, а також відео).

Рис, 2. Утворення компактного зачатка печінки при спільній культивації на чашці Петрі мезенхімних клітин, клітин ендотелію судин і клітин ентодерми печінки. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Зачатки печінки вживляли в брижийку піддослідної тварини або ж в її голову. Перевага останнього, здавалося б, дивного методу полягає в можливості спостерігати за розвитком трансплантату за життя миші. У цьому випадку в черепі тварини прорізають невелике вікно, в яке вживляється зачаток печінки, а зверху отвір закривають тонким склом. Таким чином, зачаток печінки, що розвивається, видно крізь скло, і немає необхідності забивати тварину і витягувати трансплантат, щоб вивчати її розвиток.

Рис, 3. Компактний зачаток печінки утворюється лише при вирощуванні клітин на відповідній підкладці (малюнок праворуч). LAM — ламінін, COL — колаген IV, ENT — ентактин. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Через два дні після операції судини миші, якою було пересаджено зачаток печінки, зросталися з судинами трансплантату, а на третій день за ними встановлювався нормальний кровотік. При цьому клітини вживленого зачатка печінки розмножувалися, а мережа її судин розширювалася і ускладнювалася (рис. 4). Для оцінки зрілості клітин трансплантату в крові піддослідних тварин вимірювався рівень людського сироваткового альбуміну (див. Human serum albumin). Цей білок синтезується клітинами печінки, і вимірювання його кількості дозволяє судити про функції печінки. Людський сироватковий альбумін з’являвся в крові піддослідних тварин через десять діб після трансплантації, а потім його кількість постійно зростала, що свідчило про дозрівання клітин вживленого зачатка людської печінки. Також за допомогою аналізу рівнів активності різних генів було виявлено, що через два місяці після трансплантації основна частина клітин вживленого зачатка печінки перетворилася на зрілі клітини.

Рис, 4. Розвиток мережі судин у пересадженому піддослідному тварині зачатку людської печінки. Зеленим показано клітини судин, червоним — мезенхімні стовбурові клітини, з яких формуються перицити (клітини, необхідні для підтримки стабільності мережі судин). Зображення з обговорюваної статті в Nature

Цікаво, що вживлена миші печінка, отримана з людських клітин, продовжувала функціонувати характерним для людини чином. Крім активного виробництва вищезазначеного людського сироваткового альбуміну вона здійснювала й інші свої функції «по-людськи».

Один з ключових обов’язків печінки — це знешкодження різних чужорідних для організму речовин шляхом перетворення їх в інші сполуки, менш токсичні і легше виводяться з організму. Руйнуються в печінці і ліки, що також представляють собою чужорідні для організму речовини. Шляхи таких перетворень одних і тих же речовин можуть відрізнятися у різних організмів. Зокрема, відомі певні ліки — кетопрофен і дебризоквін (Debrisoquine) — які перетворюються різними способами в печінці людини і в печінці миші.

Трансплантати печінки, отримані з людських клітин, перетворювали кетопрофен і дебризоквін дорогою, властивою для людини, але не властивою для миші. Тому миші з такими трансплантатами можуть бути використані як моделі для вивчення метаболізму людини.

Для перевірки якості роботи отриманих таким методом трансплантатів печінки використовувалася особлива лінія мишей, у яких можна було викликати гепатит при введенні ним невеликої дози дифтерійного токсину. Через тиждень після вживлення зачатка людської печінки запускалося захворювання власної печінки тварини, і виживаність тварин, яким була зроблена така операція, значно перевершувала виживаність тварин, яким не був вживлений трансплантат. Таким чином було продемонстровано, що вживлений зачаток печінки вже через тиждень після пересадки здатний досить ефективно виконувати свої функції.

Важливим результатом роботи можна вважати демонстрацію ключової ролі клітинного оточення, в якому формується зачаток майбутнього органу, на подальше його функціонування. Так, з плюрипотентних клітин можна виростити окремо клітини печінки і пересадити їх піддослідній тварині, проте такі клітини будуть працювати менш ефективно, ніж клітини, що спочатку вирощувалися в оточенні мезенхімних і судинних клітин і пересаджені в організм вже у вигляді зачатка майбутньої печінки.

Авторам роботи вдалося штучним шляхом отримати функціонуючі зачатки людської печінки, здатні продовжувати розвиток при пересадці в організм реципієнта. Зачатки були отримані завдяки створенню для клітин ентодерми печінки клітинного оточення, схожого з ембріональним, і виявилося, що посилаються клітинами один одному сигналів достатньо, щоб утворився зачаток печінки правильної форми, навіть якщо вирощувати клітини просто на плоскій поверхні.

Це означає, що при отриманні штучних органів вкрай важливо підібрати початковий склад клітин: повинні бути присутні не тільки клітини, які будуть основними робочими клітинами майбутнього органу, але також і клітини, які будуть посилати їм необхідні для правильного розвитку сигнали. Кількісний склад і підкладка, на якій ростуть клітини, також важливі для утворення зачатка органу. Якщо умови формування зачатка достатньою мірою нагадують природні умови, в яких цей орган утворюється у людського ембріона, надалі отриманий зачаток з великою часткою ймовірності буде розвиватися оптимальним чином, і орган може бути сформований остаточно вже в організмі реципієнта. При отриманні штучних органів таким методом відпадає необхідність у складних біореакторах анатомічної форми, а також у пошуку способу організації правильної внутрішньої структури органу, оскільки вона формуватиметься переважно вже в організмі реципієнта, підлаштовуючись під нього. Успіх японських дослідників дозволяє сподіватися на ефективність цього цікавого підходу до отримання трансплантатів.

Джерело: Takanori Takebe, Keisuke Sekine, Masahiro Enomura, Hiroyuki Koike, Masaki Kimura, Takunori Ogaeri, Ran-Ran Zhang, Yasuharu Ueno, Yun-Wen Zheng, Naoto Koike, Shinsuke Aoyama, Yasuhisa Adachi & Hideki Taniguchi. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant // Nature. Published online 4 July 2013. Doi:10.1038/nature12271.

Юлія Кондратенко