Вірус під мікроскопом: від візуалізації до маніпуляції

Навчання 26 серпня 2022 Перегляди: 59

Віруси є надзвичайно малими об’єктами, що мають розмір від декількох десятків до декількох сотень нанометрів. Першим і на кілька десятиліть єдиним методом їх візуалізації стала електронна мікроскопія, що дозволила не тільки детально вивчити будову самих вірусних частинок, званих віріонами, але і досліджувати процеси, що відбуваються в зараженій клітці — реплікацію вірусу. «Монополія» електронної мікроскопії була порушена появою на початку 1980-х років принципово нового класу приладів — скануючих зондових мікроскопів.

Атомно-силовий мікроскоп, що відноситься до цього класу, виявився інструментом, підходящим для дослідження біологічних об’єктів і дозволив не тільки візуалізувати нанорозмірні структури, але і маніпулювати ними. Зокрема, принципово можливою виявилася маніпуляція одиночними віріонами і прямий вимір сил, що виникають при їх контакті з поверхнею клітини. Такі експерименти дозволяють отримувати докладні дані про найперший і в багатьох випадках ще недостатньо досліджений етап зараження клітини — адгезію вірусу до її поверхні. Дані дослідження становлять і значний практичний інтерес, оскільки можуть дати ключ до створення ефективних противірусних препаратів, що захищають клітини від проникнення вірусів.

Про автора Денис Володимирович Корнєєв — науковий співробітник лабораторії ультраструктурних досліджень, голова Ради молодих вчених Державного наукового центру вірусології та біотехнології «Вектор» (Новосибірська область, Кольцово). Автор і співавтор 11 наукових робіт.

У відомій пісні Володимира Висоцького співається: «… не зрозумієш нейтрино за бороду/І не посадиш в пробірку»…. Звичайно, вірус — це не нейтрино, не атом і навіть не молекула, але все ж об’єкт настільки малий, що його неможливо побачити не тільки оком, але і в звичайний світловий мікроскоп. Однак електронна мікроскопія, яка в сотні тисяч разів збільшила можливості нашого зору, дозволила не тільки побачити ці дивовижні об’єкти, але і розглянути їх до найдрібніших подробиць. А атомно-силова мікроскопія, яка такою ж мірою загострила наше зобов’язання, дозволила здійснити пряму механічну маніпуляцію вірусними частинками.

Віруси є надзвичайно малими об’єктами — їх розміри лежать в діапазоні від декількох десятків до декількох сотень нанометрів. Першим і на довгий час єдиним методом прямої візуалізації нанорозмірних частинок стала електронна мікроскопія (ЕМ), яка почала розвиватися в 1930-ті рр. Метод, який виявився дуже інформативним, дозволив не тільки детально охарактеризувати структуру різних вірусів, але і досліджувати процеси, що відбуваються в зараженій клітці.

Виявилося, що форма вірусних частинок відрізняється великою різноманітністю: від правильних сфер до складних структур, що нагадують цеглу, обклеєну трубочками (вірус натуральної віспи), або щетинистих хробаків (вірус геморагічної лихоманки Ебола).

Ще більшу різноманітність було виявлено для стратегії реплікації (розмноження) вірусів. Єдиною фундаментальною властивістю, загальною для всіх без винятку вірусів, виявився їх статус облігатного внутрішньоклітинного паразита. Це означає, що для розмноження вірусу його генетичний матеріал повинен в обов’язковому порядку проникнути в живу клітку і «захопити» її ферментативний апарат, перемкнувши останній на виробництво копій вірусу.

Поза клітиною будь-який вірус є всього лише молекулярним контейнером з генетичним матеріалом (ДНК або РНК) і навряд чи може вважатися повноцінним живим організмом, хоча з цього питання в науковому середовищі досі немає остаточної термінологічної визначеності.

Специфікою електронної мікроскопії є вивчення фіксованих, тобто підготовлених спеціальним чином, об «єктів — по суті, вона працює лише з» мертвою «матерією *. Маючи справу тільки із «застиглими миттєвостями», дослідник може лише будувати гіпотези про динаміку процесів, що вивчаються, оскільки не має можливості спостерігати їх протягом у реальному часі.

Так, дослідження реплікації вірусу методом просвічуючої електронної мікроскопії на ультратонких зрізах виглядає наступним чином: заражені клітини обробляють фіксуючим розчином, зневоднюють спиртом і заливають спеціальною смолою. Після отвердевания смоли за допомогою спеціального приладу — ультратома — роблять ультратонкі (^ 50 нм) зрізи, які потім наносять на спеціальну сітку і обробляють розчинами солей важких металів. Під час самого мікроскопічного дослідження зразок знаходиться у вакуумній камері і піддається дії пучка електронів з енергією в кілька десятків кЕв. Очевидно, що прижиттєва візуалізація в даному випадку принципово неможлива.

Протягом майже півстоліття електронна мікроскопія залишалася єдиним методом візуалізації нанорозмірних об’єктів. Однак на початку 1980-х рр. ця монополія була порушена появою скануючої зондової мікроскопії (СЗМ). Основним принципом СЗМ є сканування — прецизійне (з високою точністю) переміщення зонда поблизу досліджуваної поверхні, пов’язане з відстеженням певного параметра, що характеризує взаємодію між зондом і зразком. Результатом такого сканування є топографічна карта рельєфу поверхні зразка.

Першим приладом СЗМ став скануючий тунельний мікроскоп (СТМ), який міг лише досить обмежено використовуватися для візуалізації біологічних об’єктів, оскільки для його роботи потрібна висока електрична провідність досліджуваної поверхні.

У 1986 р. швейцарський фізик Г. Бінніг і його колеги створили новий прилад сімейства СЗМ — атомно-силовий мікроскоп (АСМ). В основі його роботи лежить силова (Ван-дер-Ваальсове) взаємодія атомів зонда і поверхні. АСМ не потрібна електрична провідність поверхні зразка, і він може здійснювати зйомку в рідкому середовищі. Тому цей прилад виявився зручним інструментом для дослідження біологічних об’єктів.

Принципова схема роботи атомно-силового мікроскопа (АСМ). Чутливим елементом АСМ є пружна консоль (кантилевер), на кінці якої закріплений гострий зонд. Сили, що виникають між атомами гострія зонда і досліджуваною поверхнею призводять до деформації кантилевера, яка в свою чергу фіксується за допомогою оптичної системи, реалізованої в більшості сучасних АСМ на основі напівпровідникового лазера і чотирьохсекційного фотоприймача. Розмір кантилевера — 100 ­ 300 20 ­ 40 мкм при товщині близько 2 мкм. Висота зонда — близько 10 мкм

З моменту появи атомно-силового мікроскопа було опубліковано величезну кількість робіт, присвячених АСМ-візуалізації найрізноманітніших біологічних зразків. Слід все ж визнати, що в більшості випадків в плані візуалізації АСМ не дає нічого принципово нового в порівнянні зі звичайною електронною мікроскопією, тому часто даний метод сприймається біологами як технічна екзотика, а не як повноцінний дослідницький інструмент.

Однак найважливішою, нехай і майже єдиною перевагою візуалізації біологічних об’єктів за допомогою АСМ порівняно з електронною мікроскопією є можливість виконання досліджень нативних, природних зразків без будь-якої фіксації та спеціальної пробопідготовки, при фізіологічних параметрах середовища.

Крім візуалізації рельєфу поверхні з субнанометровою роздільною здатністю АСМ дозволяє здійснювати прямий вимір сил, що виникають при взаємодії одиночних нанорозмірних об’єктів.

Проводяться такі вимірювання наступним чином: один об’єкт закріплюється на вістрі зонда АСМ, а другий фіксується на підкладці, після чого зонд підводиться до поверхні підкладки до досягнення механічного контакту, а потім повертається назад. Під час цього переміщення відстежується деформація упругої консолі (кантилевера). Залежність цього параметра від відстані між зондом і підкладкою називається силовою кривою. З її допомогою можна визначити величину сили, що діє між досліджуваними об’єктами. Цей метод, названий атомно-силовою спектроскопією (АСС), може використовуватися для дослідження силових характеристик взаємодії найрізноманітніших малих об’єктів: від неорганічних наночастинок до вірусів і живих клітин.

Метод атомно-силової спектроскопії дозволяє визначити величину сили, що діє між досліджуваними об’єктами. Для цього один об’єкт закріплюється на вістрі зонда АСМ, а другий фіксується на підкладці. Зонд підводиться до поверхні підкладки і потім піднімається назад. Залежність деформації кантилевера від відстані між зондом і підкладкою називається силовою кривою

Початковим етапом зараження клітини вірусом є адгезія (прилипання) вірусної частинки (віріона) до клітинної поверхні з подальшим проникненням генетичного матеріалу вірусу всередину клітини. Цей процес, визначений взаємодією білкових рецепторів, розташованих на поверхні клітини, з поверхневими білками віріону, є критично важливим для розмноження вірусу. І, треба зазначити, в більшості випадків вивчений недостатньо.

Воістину захоплюючі перспективи досліджень у цьому напрямку відкриває АСС. Зафіксувавши одиночну вірусну частинку на вістрі зонда АСМ, можна здійснити вимір сили, що виникає при контакті вірусної частинки з поверхнею клітини, дослідити кінетичні характеристики даної взаємодії і навіть «втиснути» віріон всередину клітини, одночасно ведучи спостереження за допомогою потужного світлового мікроскопа. У такому експерименті дослідник з пасивного спостерігача перетворюється на активного учасника процесу, здійснюючи механічну маніпуляцію досліджуваним нанорозмірним об’єктом — таку можливість не може надати жоден з інших видів мікроскопії.

Однак фіксація одиночної вірусної частинки на вістрі зонда атомно-силового мікроскопа є досить непростим завданням. Для успішного проведення експерименту потрібна велика підготовча робота:

• отримати якомога більш чистий і концентрований препарат вірусу;
• підготувати на вістрі зонда майданчик відповідного розміру для посадки віріона;
• хімічно активувати поверхню зонда для утворення ковалентних зв’язків при контакті з білками вірусу;
• переконатися в тому, що на зонді закріпився дійсно віріон, а не молекули вільного білка або дрібні фрагменти клітин, завжди присутні в препаратах вірусів.

Оцінка концентрації та ступеня чистоти препарату вірусу зазвичай проводиться методом просвічувальної електронної мікроскопії. Майданчик на вістрі АСМ-зонда, який зазвичай виготовляють з кремнію або його нітрида, формують шляхом тривалого сканування кремнієвої або сапфірової підкладки при великих значеннях розгортки і сили притиснення зонда до поверхні. Найбільш наочною ілюстрацією для цього процесу служить зміна форми гостру олівцю в ході інтенсивного малювання.

Адекватним методом контролю геометричних параметрів зонда атомно-силового мікроскопа (а) при створенні майданчика для посадки віріона, є електронна мікроскопія, як скануюча, так і просвічуюча:б — майданчик на вістрі зонда для посадки великої вірусної частинки; в — вірусоподібна частинка, закріплена на вістрі зонда. Просвічуюча електронна мікроскопія (JEM 1400, Jeol, Японія)

Головне питання, на яке необхідно відповісти при інтерпретації будь-яких результатів атомно-силової спектроскопії, можна сформулювати наступним чином: «Сили між якими об’єктами були виміряні?»

За мірками мікроскопії, клітина вищих організмів є відносно великим (^ 10 мкм) об’єктом, тому добре видно у світловому мікроскопі, за допомогою якого на неї наводиться кантилевер атомно-силового мікроскопа. Але як бути з самим зондом, на вістрі якого передбачається наявність віріона? Строго кажучи, замість віріона там може опинитися все, що завгодно: моношар білкових молекул, фрагмент клітини або віріона, агрегат з декількох віріонів, випадкове забруднення тощо. Крім того, в процесі вимірювання віріон може зруйнуватися або відірватися від зонда. Візуалізація ж зонда з вірусною часткою методом електронної мікроскопії до силових вимірювань неприпустима, оскільки під впливом висушування, вакууму і пучка електронів віріон набуде незворотних змін.

Найбільш ефективним методом вирішення даної проблеми виявилася візуалізація гострія зонда АСМ за допомогою електронної мікроскопії, здійснювана безпосередньо після силових вимірювань. Якщо на вістрі буде виявлена вірусна частинка, що вціліла в ході експерименту, то всі сумніви розвіються.

Протягом останніх п’ятдесяти років в результаті воістину титанічної роботи, виконаної електронними мікроскопістами всього світу, накопичено величезний багаж знань в області ультраструктурних аспектів реплікації різних вірусів. Створення атомно-силового мікроскопа і техніки силової спектроскопії дозволило впритул наблизитися до довільної механічної маніпуляції одиночними вірусними частинками. Це виводить вивчення взаємодії вірусу з кліткою на принципово інший рівень — від структурних досліджень до функціональних.

При цьому атомно-силова спектроскопія не є конкурентом для електронної мікроскопії, а відкриває новий самостійний напрямок досліджень — наномеханіку взаємодії вірусної частинки з поверхнею клітини. Дуже ймовірно, що в найближчому майбутньому в даному напрямку будуть здійснені фундаментальні відкриття, співмірні за значимістю з досягненнями електронної мікроскопії в середині минулого століття.

Вивчення механізмів пов’язування вірусних частинок з поверхнею клітини викликає значний інтерес не тільки з позиції фундаментальної науки, але і в контексті практичних додатків. Більш детальне розуміння цих механізмів на молекулярному рівні може дати людству ключ до створення ефективних противірусних препаратів, що захищають клітини від проникнення вірусів.

У публікації використані фото автора

Література1

. Корнєєв Д.В., Бессуднова Є.В., Зайцев Б.М. Вивчення взаємодії наночастинок TiO₂ та поверхні еритроцитів людини методом атомно-силової спектроскопії//УНЖ. 2012. № 4. С. 73-77.2.

Миронов В.Л. Основи скануючої зондової мікроскопії. Нижній Новгород: ІФМ РАН, 2004. 182 ц.3.

Alsteens D., Pesavent E., Cheuvart G. et al. Controlled manipulation of bacteriophages using single-virus force spectroscopy // ACSNANO. 2009. V. 3 (10). P. 3063–3068.4.

Alsteens D., Trabelsi H., Soumillion P., Dufrene Y. F. Multiparametric atomic force microscopy imaging of single bacteriophages extruding from living bacteria // Nature Communications. V. 4. Article number: 2926.5.

Binnig G., Quate C. F., Gerber Ch. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56 (9). P. 930–933.6.

Cappella B., Dietler G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surf. Sci. Rep. 1999. V. 34. P. 1–104.7.

Malkin A. J., Plomp M., McPherson A. Unraveling the architecture of viruses by high-resolution atomic force microscopy // Methods Mol. Biol. 2005. V. 292. P. 85–108.

^* Просвічуюча електронна мікроскопія з використанням спеціальної рідинної комірки і скануюча електронна мікроскопія при атмосферному тиску дозволяють досліджувати біологічні об’єкти без фіксації, але через низку технічних труднощів і відносно низький просторовий дозвіл ці методи не отримали широкого поширення.