Деконструкція генома

Він встав, зняв халат, єрмолку, туфлі. Зняв полотняні штани і сорочку. Зняв, як перука, голову, зняв ключиці, як ремені, зняв грудну клітку, як кольчугу. Зняв стегна, зняв ноги, зняв і кинув руки, як рукавиці, в кут. Те, що залишалося від нього, поступово розсіялося, ледь забарвивши повітря. <...> Цинциннат, тебе освіжила злочинна твоя вправа.

Володимир Набоков. «Запрошення на страту»

Той, хто вміє дивувати

Крейг Вентер — одна з найбільш колоритних персон у сучасній науці про живе. Він народився 1946 року і не дуже цікавився академічним знанням, поки не побував у В’єтнамі, де працював у польовому госпіталі. Військовий досвід спонукав його серйозно зайнятися медициною, потім він зрозумів, що біологія приваблює його сильніше, і вже в 1975 році отримав докторський ступінь. Справжньою знаменитістю Крейг Вентер став, коли створена ним компанія Celera Genomics пообіцяла розшифрувати геном людини швидше і дешевше, ніж міжнародний проект, що поставив ту ж мету. І Celera зробила це: точність розшифровки у них була нижчою, ніж у «Генома людини», але і вартість вийшла відносно низькою: близько 300 мільйонів проти 3 мільярдів доларів.

Не обійшлося без конфліктів: більшість вчених вважала, що доступ до геному людини повинен бути вільним і безкоштовним, а Крейг Вентер збирався надавати додаткові дані, отримані Celera, за платною підпискою, щоб окупити витрати компанії. Багато хто вважав це аморальним, Вентеру дорікали за корисливість і нелюдяність. Однак у 2002 році він залишив посаду президента компанії через розбіжності з головним інвестором — за власними словами Вентера, підприємництво для нього було лише джерелом фінансування наукових проектів. У середині 2000-х на світ з’явився Інститут Джона Крейга Вентера (JCVI) — некомерційна організація, що займається геномними дослідженнями.

У 2007 році співробітники JCVI зі співавторами з інших країн опублікували статтю, в якій оголосили про початок ери індивідуальної геноміки, а додатком до неї був власний геном Джона Крейга Вентера, доступний будь-якому бажаючому (PLoS Biology, 2007, 5 (10): e266. doi:10.1371/journal.pbio.0050266). Отримані до того геноми людини були складені з ділянок ДНК багатьох донорів, здебільшого анонімних. Відтоді рідко яка стаття про Вентера обходиться без згадки про те, що у нього є гени схильності до асоціальної поведінки. Детальніше про геномні проекти Крейга Вентера можна прочитати в його книзі «Розшифроване життя. Мій геном, моє життя «(М.:»Біном. Лабораторія знань «, 2015).

Інший проект Крейга Вентера — широкомасштабне дослідження геномів морських мікроорганізмів, яке має наблизити нас до розуміння фундаментальних закономірностей екології моря, зокрема перетворень вуглецю. Крім того, у морських організмів можна знайти корисні гени для потреб науки і біотехнологій. У 2005 році Крейг Вентер став одним із засновників компанії Synthetic Genomics, яка працює над отриманням бактерій, дріжджів і водоростей, здатних виробляти біопаливо — етанол і водень. Серед партнерів Synthetic Genomics — корпорації Exxon Mobil і British Petroleum, нині BP plc (ну раптом у цих біологів вийде?).

Але щоб створити організм з потрібними властивостями — бактерію, яка виробляє біодизель, або щось ще більш амбітне, — треба розуміти, як влаштоване життя. Щоб писати програми тією мовою, яка використовується в ДНК, треба цю мову вивчити. Нам вже недостатньо знати, які послідовності ДНК запускають і переривають синтез РНК і якому триплету яка амінокислота відповідає, — нам треба знати, яке місце займає продукт гена в житті клітини, які її властивості забезпечує, з якими іншими продуктами функціонально пов’язаний і т. д. А якщо підручників з мови програмування немає під рукою, але дуже хочеться? Тоді залишається неправильний підхід: написати невелику програмку самому, де розумієш, як треба робити, — використовувати розуміння, де не розумієш, — потягнути фрагменти чужих програм (їх-то вистачає — розшифрованих геномів все більше), потім запустити і подивитися, що вийде. Приблизно цим Крейг Вентер з колегами займається як мінімум 20 років.

Народження Синтії

У 1996 році група співробітників TIGR (The Institute for Genomic Research, створений Вентером у 1992-му, згодом став частиною JCVI) секвенувала геном Mycoplasma genitalium. Ця бактерія живе в статевих і дихальних системах приматів, і геном її — один з найкоротших, всього півмільйона пар підстав і півтисячі генів. Зрозуміло, паразит харчується за рахунок чужих ресурсів, мешкає в стабільних умовах і може обійтися без багато чого, що потрібно незалежним істотам.

Як розібратися, навіщо потрібен той чи інший ген з п’ятисот і чи потрібен взагалі? Класичний спосіб біологів — псувати їх і дивитися, як живеться бактерії без даного гена, що для неї змінилося. Для цього в Інституті Вентера розробили метод транспозонного мутагенезу: мобільні генетичні елементи вбудовувалися в геноми бактерій випадковим чином, потім бактерій висівали на живильне середовище і читали геноми тих, хто вижив, починаючи від цього елемента, щоб з’ясувати, куди потрапила «опечатка». Можна також порівнювати геном «вашої» бактерії з геномами інших організмів, виходячи з припущення, що подібні гени кодують білки зі схожими функціями. А коли ми дізнаємося досить багато — спробувати створити геном «з нуля».

Принципова особливість ідеї Крейга Вентера була в тому, щоб і ДНК отримати синтетичну, а не брати готову, наприклад копіюючи і зшиваючи разом фрагменти чийогось геному. Завдання було, м’яко кажучи, непростим. Синтезувати в пробірці можна тільки невеликі фрагменти ДНК: довгі молекули рвуться, якщо їх не оберігає клітинна машинерія, звична до поводження з крихким носієм інформації. Тому фрагменти клонували в клітинах кишкової палички і з’єднували, поки не отримали чотири великих фрагмента, кожен приблизно по чверті геному M. genitalium, а ті вже зібрали в дріжджових клітинах. (Це дуже коротка розповідь без технічних подробиць.)

У січні 2008 року Інститут Крейга Вентера оголосив про те, що геном мікоплазми повністю синтезований. Отриманою ДНК дали назву Mycoplasma genitalium JCVI-1.0.

Наступним кроком мало стати перенесення синтетичного геному в клітку мікоплазми, з якої видалено її власний геном. Але справа не пішла: ДНК, клонована в дріжджах, відмовлялася керувати живою кліткою, хоча геном, витягнутий з клітини мікоплазми одного виду, прекрасно приживався в інший. Вчені припустили, що причина в метилуванні — вибірковому приєднанні СН3-груп до нуклеотидів, яке не змінює послідовність «букв» геному, але регулює активність генів. Дріжджова клітина не змогла забезпечити правильного малюнка метилювання, так що перезапуск програми не вдався. Довелося отримувати ферменти мікоплазми, що відповідають за метилування, і обробляти ними хромосоми, витягнуті з дріжджових клітин.

У 2009 році вийшла стаття в Science (2009, 325, 5948, 1693-1696, doi: 10.1126/science.1173759) — команда Вентера клонувала цілий геном Mycoplasma mycoides в дріжджах і потім помістила його в клітку близькоподібного виду — M. capricolum. Це була ще не синтетична ДНК, але в дріжджовій клітці геном піддався модифікаціям, так що створення нового життєздатного штаму M. mycoides Крейг Вентер міг записати собі в актив.

Нарешті, в 2010 році поставлене завдання було вирішено в повному обсязі: синтетичний геном M. mycoides прижився в клітці M. capricolum (Science, 2010, 329, 5987, 52-56, doi: 10.1126/science.1190719). Нова бактерія отримала ім’я Mycoplasma laboratorium JCVI-syn1.0, а неформально її називали Сінтією (від «синтетичний»).

Своє створення вчення позначили — ввели в геном послідовності, яких не було у M. mycoides, несучі зашифровані послання тому, хто зловить штучну мікоплазму (хоча навряд чи вона здатна втекти в дику природу) і прочитає її геном. У цих посланнях кожен з нуклеотидних триплетів позначав букву латинського алфавіту або цифру. Серед «водяних знаків» в геномі Сінтії — HTML-скрипт, який в браузері читається як привітання побудовнику, перелік авторів статті, а також цитати з Джеймса Джойса («Жити, помилятися, падати, тріумфувати, відтворювати життя з життя»), Роберта Оппенгеймера («Бачити не те, що є, що є, те» може «»,, хоча, точності заради, у Фейнмана було «створити»).

Спадкоємці Джойса висловили невдоволення, що Вентер і компанія не поставили їх до відома і не запитали дозволу, перш ніж вставити безсмертну сходинку в бактерію. До судових розглядів справа не дійшла (хоча «зіпсований телефон» Інтернету пропонує і таку версію подій), так що мікоплазма продовжує несанкціоноване копіювання класичного тексту. Цікаво було б поглянути, чи не попсували його мутації, чи не перетворилося, наприклад, «жити» на «пити»…

Лише необхідне

Цитати, як бачимо, були підібрані зі змістом, але чи завжди ми можемо зрозуміти, те, що побудували? Як писав філософ Деніел Деннетт з університету Тафтса: «Коли переходиш від спроб моделювати речі за допомогою рівнянь до виробництва досконалих комп’ютерних моделей <... > ти можеш закінчити моделлю, що тонко моделює природу, але ти не розумієш модель». Це можна віднести і до роботи Вентера з колегами: точна копія геному мікоплазми не набагато зрозуміліша, ніж сам геном мікоплазми. Так, експеримент довів, що ми нічого не упустили, — ДНК геному достатньо, щоб передати у спадок всі важливі властивості і підтримувати життя клітини. Але тепер настав час наступного кроку — видалити все непотрібне або не дуже потрібне, створивши мінімальний геном.

Уявлення про «коровий» (серцевинний) набір генів, необхідний для виживання клітини, виникло давно. Його, зокрема, сформулювали Аркадій Мушегян і Євген Кунін ще в 1996 році. Вони порівнювали геноми M. genitalium і Haemophilus influenza — до речі, і той, і інший секвенувала команда Вентера — і отримали, що такий набір повинен включати 256 генів (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1996, 93,  10268-10273). А над цим базисом різні види створюють свої надбудови, які дають їм всілякі переваги, великі і малі, але для життя і розмноження в ідеальних умовах вони необов’язкові.

У науці є багато теоретичних істот: одні, на зразок демона Максвелла, мешкають лише в уяві вчених, інші, як Останній Загальний Предок всіх живих клітин, були насправді, але настільки далекі в часі, що вигляд їх туманний. Вентер зі співавторами втілили в реальність один з експонатів умозрительного бестіарію — Клітку С Мінімальним Геномом. Або принаймні робоче наближення до цього ідеалу.

Були й інші проекти зі схожими завданнями: наприклад, у кишкової палички видаляли гени один за одним, істотно зменшуючи розмір її геному. Але автори статті підкреслюють, що вони почали знизу, а не зверху: синтезували «з нічого» мінімальний геном і подивилися, чи зможе він функціонувати. Самі вони називають те, що роблять, — «повногеномний дизайн».

Синтетичне життя, версія 3.0

Успіх прийшов не відразу. Гіпотетичний мінімальний геном (HMG) побудували за раніше наявними даними про гени мікоплазми, про те, які з них потрібні, а які не особливо або не потрібні зовсім. Гени видаляли з геному M. laboratorium JCVI-syn1.0 — геном M. genitalium менше, але вона повільно зростає, до того ж syn1.0 — свою, рідну тварину, капризи якої добре знайомі її творцям. Довелося розробити певні «правила синтаксису» при видаленні, з тим, щоб воно не вплинуло на потрібні гени: згадаймо, наприклад, що у бактерій послідовності генів часто перекриваються і, видаливши один, можна обрізати інший. Геном синтезували, як і при створенні syn1.0, шляхом послідовного складання фрагментів. На заключному етапі отримали вісім сегментів, що перекриваються краями.

На початку 90-х років студенти біофаку МДУ передавали один одному зошити з рукописним перекладом «Володаря перснів». (Література в жанрі фентезі ще не стала індустрією, персональні комп’ютери були в одиниць — нашим дітям цього не зрозуміти.) Один із зошитів загубився, і на обкладинці попередньої було написано її короткий зміст: «Фродо, Сем і Горлум йдуть через страшні жахливі болота, де всі, особливо Фродо, мало не потонули, потім вони зустрічають брата Боромира, який, однак, на нього зовсім не схожий…» Слабка заміна повному тексту, але все-таки можна читати далі. Приблизно так само Вентер і співавтори перевіряли на осмисленість кожен з восьми сегментів. Вони створили вісім тестових комбінацій: у кожній один сегмент був з HMG, інші сім — з syn1.0. Сім повних зошитів і один короткий зміст. Читабельною виявилася лише одна комбінація, де на мінімальний був замінений фрагмент номер 2, всі інші варіанти вийшли нежиттєздатними. Стало зрозуміло, що якісь гени марно вважали непотрібними.

Перший етап був по-своєму корисним: наприклад, вдалося підвищити точність синтезу ДНК і збільшити швидкість збірки генома — тепер вона займала менше трьох тижнів, а не місяці і роки. Але як визначити, які слова треба повернути в текст, щоб він читався?

Геномні дизайнери знову використовували транспозонний мутагенез: піддали йому syn1.0, отримали колонії бактерій, що вижили, і досліджували їхні геноми. Якщо ген розірваний вбудовою транспозону, а бактерія все ще жива, значить, цей ген не потрібен. Таких вбудовів (інсерцій) було знайдено 30 000. Потім клітини пересівали понад 40 разів і дивилися, які мутації збережуться після пересівів, — «хворі» клітини, що ростуть повільно, при цьому зникали. У новому поколінні мутацій було набагато менше — близько 14 000. Можна було припустити, що ті 16 000 мутацій, які зникли при пересівах, пошкоджували гени, без яких жити можна, хоча б погано, а ті, які залишилися, — потрапили в гени, які дійсно не потрібні.

Після цього вчені поділили гени syn1.0 на три групи: необхідні essential, e-гени), непотрібні (nonessential, n-гени) і квазінеобхідні, що викликають сумісні з життям пошкодження (impairment — i-гени, ті самі, що були пошкоджені мутаціями, зниклими при пересівах). Останні, в свою чергу, поділили на більш і менш необхідні, залежно від того, наскільки сильно сповільнювалося без них зростання.

На підставі цих даних побудували новий варіант мінімального геному, який назвали RGD1.0 (від reduced genome design). Він був удвічі коротшим за геном syn1.0, з нього видалили майже всі n-гени (крім тих, які перебували між великими кластерами потрібних генів, і тих, чиї біохімічні функції представлялися важливими всупереч даним по мутагенезу). Потім знову синтезували вісім сегментів, скомбінували кожен з сімома фрагментами syn1.0. Тепер усі вісім комбінацій виявилися життєздатними. Правда, одна, зі скороченим сегментом 6, зростала дуже повільно: як з’ясувалося, в ній виявилися незаплановані пошкодження. Після виправлення дефекту все налагодилося.

Залишилося зібрати скорочений геном з восьми фрагментів… ага, як же! Комбінація восьми скорочених фрагментів знову була нежиттєздатною. Таке цілком могло статися. Уявімо, що ферменти А і В обидва здійснюють одну і ту ж реакцію, при цьому А знаходиться в сегменті 1, а В — в сегменті 3. Фермент А може бути пошкоджений без шкоди для життя, якщо збережений В, і навпаки, таким чином, А і В будуть здаватися непотрібними і в експериментах з мутагенезу, і при збірці геномів з фрагментами syn1.0. А ось на фінальному етапі вилізе помилка: необхідна реакція в клітці не піде.

Тоді вчені створили набори різноманітних комбінацій сегментів RGD1.0 і syn1.0. Життєздатною виявилася версія з сегментами 2, 6, 7 і 8 від RGD1.0 і 1, 3, 4, 5 — від syn1.0. Причому вельми життєздатною — число клітин подвоювалося за 105 хвилин, а у syn1.0 — приблизно за годину. Тепер вже цю конструкцію піддали транспозонному мутагенезу і з’ясували, які нібито непотрібні гени в сегментах 1, 3, 4, 5 не можна було чіпати, тому що в новому контексті вони перейшли в категорію необхідних або квазінеобхідних. Синтезували ці сегменти заново — і нарешті отримали живу клітку, яку назвали JCVIsyn2.0 (довжина геному — 576 пар підстав, 478 генів білків і 38 генів РНК). На останньому етапі вони змогли видалити ще 42 гени і нарешті отримати JCVI-syn3.0 з геномом менше, ніж у M. genitalium (Science, 2016, 351, 6280, doi: 10.1126/science.aad6253).

Геноми різних біологічних видів

Коли цю «майже мінімальну» конструкцію ще раз піддали мутагенезу, вбудови спостерігалися головним чином в міжгенних послідовностях, іноді — в генах, умовно необхідних. Геном Синтії Третьої складався в основному з генів, які в перших дослідах були віднесені до e— і i-груп.

Що це за гени? Видалено передусім вставки мобільних елементів, гени модифікації та рестрикції ДНК. Оскільки клітини росли на багатому середовищі, виявилося можливим також видалити деякі гени, що відповідають за метаболічні процеси. (Наприклад, глюкози в середовищі багато, значить, вміння використовувати альтернативні джерела вуглецю не так вже й потрібно.) З іншого боку, бажано залишити те, що забезпечує копіювання та зчитування генетичної інформації, ділення клітини, формування тривимірної структури білків, клітинний метаболізм, а також функціонування мембранних структур, — навіть перебуваючи в найсприятливішому середовищі, треба вміти всмоктувати поживні речовини і підтримувати гомеостаз.

Однак 79 генів все-таки не вдалося включити ні в одну з цих категорій, і принаймні 19 серед них — е-гени. Автори статті оптимістично припустили, що це найцікавіше: можливо, невідомі гени забезпечують невідому, але, очевидно, дуже важливу біологічну функцію.

Як виглядає і що вміє

Скорочена версія повільніше реплікується, ніж syn1.0 (час подвоєння — близько трьох годин). В іншому обидві Синтії схожі один на одного і на свою прабатьківницю M. mycoides. Але цікаво, що на відміну від першої версії третя схильна утворювати агрегати в рідкій культурі, правда, легко руйнуються.

Синтія Перша і Синтія Третя: загальний вид в рідкій культурі і «портрети» окремих клітин. Добре видно нітевидні структури, які утворює syn3.0. Втім, вони легко руйнуються при збалтуванні

Деякі піонери синтетичної біології, наприклад Джордж Черч, висловлювалися про бактерію Крейга Вентера скептично: дуже складно, дуже дорого і в кінцевому рахунку не робить нічого такого, чого не могла б робити стара добра кишкова паличка. Однак Вентер і співавтори намітили кілька можливих застосувань Сінтій.

Для початку вони вирішили перевірити, що станеться, якщо розташувати гени в геномі не так, як у геномі «дикої» мікоплазми, а відповідно до логіки — якщо функціонально пов’язані гени поставити поруч. (До речі, у бактерій і в природі часто так буває: поруч розташовуються, наприклад, гени, продукти яких забезпечують послідовні перетворення однієї речовини.) Подібна реорганізація сегмента 2 у syn1.0 як мінімум не забарилася її зростання. А ще дослідники вставили в геном syn3.0 злегка змінений ген 16S РНК рибосоми — тобто підправили одну з деталей машини, що синтезує білки! І це пройшло благополучно. Можливо, такі тонкі експерименти зручніше ставити в повністю контрольованому середовищі.

Отже, у нас є жива клітина в базовій конфігурації або щось досить близьке до неї. Чи ми навчимося ускладнювати програму, дописувати нові функції, конструюючи бактерію, здатну перетворювати шматки поліетилену і картопляне очищення на високооктановий бензин? Або іншу — сировину нехай те ж саме, але в глюкозу? І заодно третю, яка виробляє органіку з метану, вуглекислого газу і азоту під дією сонячного світла, спеціально для потреб тераформування далеких планет… Порівняно з тим, що вже зроблено, неможливим все це не здається.