Динамічні мікротрубочки: від експериментів до моделей

Про авторів

Мікротрубочки — один з трьох основних типів білкових ниток клітини. Разом з актиновими і проміжними філаментами вони утворюють клітинний каркас — цитоскелет. Завдяки своїм унікальним механічним властивостям мікротрубочки виконують цілий ряд ключових функцій на всіх етапах життя клітини, в тому числі допомагають організувати її вміст і служать «рейками» для спрямованого транспорту внутрішньоклітинних «вантажів» — везикул і органелл. Мікротрубочки — динамічні структури, вони постійно змінюють свою довжину за рахунок зростання або вкоратування. Така поведінка, звана динамічною нестабільністю, істотно впливає на різні внутрішньоклітинні процеси. Наприклад, якщо клітина випинає частину цитоплазми під час амебоїдного руху, мікротрубочки швидко заповнюють новий об’єм, підвищуючи в ньому інтенсивність внутрішньоклітинного транспорту. Частина цих філаментів вибірково стабілізується, тим самим задаючи напрямок, уздовж якого переміщення «вантажів» відбувається більш регулярно. Вздовж виділеної лінії активуються внутрішньоклітинні процеси, а отже, створюються умови для виникнення у клітини полярності. Головну роль динаміка мікротрубочок відіграє під час клітинного ділення. Їх здатність змінювати довжину інтенсивно досліджується вже більше 30 років, проте механізми, що лежать в основі цього феномену, все ще погано вивчені.

Будова і властивості мікротрубочок

Ріс. 1. Схема мікротрубочки

Мікротрубочки — це лінійні полімери. Вони побудовані з дімерів білка тубуліну, які утворюють 13 ланцюгів — протофіламентів (рис. 1). Кожен з них з боків пов’язаний з двома іншими, і вся конструкція замкнута в циліндр діаметром 25 нм. Така будова забезпечує мікротрубочці міцність і велику вигинну жорсткість: вона може залишатися майже абсолютно прямою в масштабі клітини. Щоб уявити, наскільки мікротрубочка складно згинається, подумки збільшимо її до розмірів стрижня діаметром спагетті (близько 2 мм). Така «спиця» не прогиналася б, будь вона довжиною навіть у сотні метрів (висота сучасних хмарочосів)! Жорсткість дозволяє мікротрубочкам виконувати роль довгих прямих напрямних, які організовують рух органелл всередині клітини. Інші елементи цитоскелета (актинові та проміжні філаменти) суттєво гнучкіші, тому, як правило, використовуються клітиною в інших цілях.

Дімір тубуліну, з якого будується мікротрубочка, складається з мономерів двох типів. Всередині кожного протофіламента лід-мономери одного дімера з’єднуються з лід-мономерами сусіднього. Тому по всій довжині мікротрубочки, що містить десятки і сотні тисяч дімерів тубуліну, всі вони орієнтовані однаково. Той кінець мікротрубочки, до якого звернені лід-тубуліни, називається мінус-кінцем, а протилежний — плюс-кінцем. Завдяки такому впорядкованому розташуванню дімерів мікротрубочка має полярність, що забезпечує спрямованість транспорту. Моторні білки, які беруть участь у переміщенні «вантажів» з однієї частини клітини в іншу, «крокують» по мікротрубочці, перетягуючи свою «ношу» за собою, як правило, тільки в одному напрямку. Наприклад, білок дінеїн рухає органели до мінус-кінця мікротрубочки, а кінезин — до плюс-кінця. Часто мікротрубочки розташовані в клітці радіально, а їх плюс-кінці спрямовані до її периферії. Таким чином, кінезини здійснюють транспортування з центру до зовнішньої мембрани, а дінеїни — від неї всередину клітини. Вражаюче, але у відростках аксонів везикули та органели можуть спрямовано пересуватися по мікротрубочках на відстані в сотні мікрометрів і більше.

Динамічна нестабільність: в клітинах і в пробірці

Рис, 2. Характерна кінетика полімерізації звичайного біополімера (помаранчева крива) і мікротрубочки (синя)

Від звичайних біополімерів мікротрубочки відрізняються не тільки механічними властивостями, але й унікальною динамічною поведінкою (рис. 2). Звичайний полімер росте монотонно до тих пір, поки швидкість приєднання нових суб’єдиниць з розчину не зрівняється зі швидкістю відділення вже прикріплених. Полімерізація ж мікротрубочки носить коливальний характер. Її довжина поперемінно то збільшується, то зменшується при фіксованій концентрації дімерів тубуліну в розчині. В одних і тих же умовах співіснують зростаючі мікротрубочки. Переходи від стадії зростання до вкорочення називають катастрофами, а зворотні — порятунками. Вперше таку поведінку — динамічну нестабільність — виявили Т.Мітчісон (T. Mitchison) і М. Кіршнер (M. Kirschner) близько 30 років тому [1].

Динамічна нестабільність мікротрубочок особливо важлива під час мітозу. З них будується спеціальний апарат для поділу клітини — веретено ділення. Воно центрується завдяки мікротрубочкам, які відштовхуються від клітинної мембрани. Далі, подовжуючись і вкорачуючись, вони «обшукують» простір клітини в пошуках хромосом. Відшукавши їх і закріпившись за них своїми кінцями, мікротрубочки розвивають тягучі і штовхаючі сили, переміщуючи хромосоми до екватора клітини. Чітко вибудувавши на ньому генетичний матеріал і тим самим забезпечивши готовність клітини до поділу, мікротрубочки розтягують хромосоми до клітинних полюсів. Все це відбувається завдяки динамічній нестабільності мікротрубочок. Незамінна роль динаміки мікротрубочок у мітозі призвела до розробки ліків від онкологічних захворювань. Так, наприклад, низькомолекулярна речовина таксол — відомий протипухлинний препарат, що стабілізує мікротрубочки, а значить, зупиняє ділення ракових клітин.

Нестабільність мікротрубочок проявляється не тільки в клітинах, але і в пробірці — в розчині білка, що їх утворює. Отже, для прояву ними цієї властивості не потрібно нічого, крім тубуліну. Він приєднується з розчину до кінця мікротрубочки під час фази її росту або, навпаки, відокремлюється і йде назад в розчин під час стадії укорачивання. Тим не менш, інші клітинні білки можуть впливати на параметри динамічної нестабільності, наприклад, прискорювати зростання мікротрубочок в клітинах, змінювати (збільшувати або зменшувати) частоти катастроф і порятунків. Відомо, що в пробірці швидкість росту мікротрубочок і ці частоти багаторазово нижче, ніж у клітинах при тій же концентрації тубуліну.

Модель ГТФ «шапочки»

Чому мікротрубочки, на відміну від інших біополімерів, динамічно нестабільні? Зростання мікротрубочки, як сказано, відбувається завдяки приєднанню до її кінця дімерів тубуліну. Кожен мономер цього білка пов’язаний з молекулою гуанозинтрифосфата (ГТФ). Однак незабаром після приєднання тубуліну до мікротрубочки молекула ГТФ, пов’язана з лід-суб’єдиницею, гідролізується до гуанозиндифосфату (ГДФ). ГТФ-дімери тубуліну в складі протофіламента прагнуть витягнутися, утворити лінійну структуру, а ГДФ-дімери — зігнутися в ріжок з радіусом кривизни близько 20 нм. За рахунок постійного приєднання ГТФ-дімерів мікротрубочка подовжується, а на її кінці формується «пояс» з молекул, що ще не встигли гідролізувати ГТФ. Намагаючись випрямитися, цей шар — ГТФ- «ковпачок» (або «шапочка») — не дає вигнутися назовні нижчим ГДФ-дімерам і таким чином запобігає зростаючий кінець мікротрубочки від розбирання. Вважається, що мікротрубочка стійко зростає і захищена від катастрофи, поки на її кінці є ГТФ- «шапочка». Зникнення останньої внаслідок гідролізу або випадкового відділення ГТФ-дімерів тубуліну переводить мікротрубочку у фазу вкорочення.

Модель ГТФ- «шапочки» з’явилася практично відразу після відкриття динамічної нестабільності і підкорила дослідників своєю простотою і елегантністю. Отримано вже досить багато експериментальних фактів, що підтверджують цю модель. Один з класичних дослідів, що показують, що на кінці мікротрубочки є якась стабілізуюча структура, полягає в наступному. Зростаючу мікротрубочку перерізають мікроіглою або сфокусованим пучком ультрафіолетового світла [2, 3]. Плюс-кінець з відрізаного боку негайно починає розбиратися. Цікаво, що мінус-кінець з боку розрізу зазвичай не розбирається, а продовжує рости. Р.Ніклас (R. Nicklas) робив схожий досвід, але розрізав за допомогою мікроігли мікротрубочку в мітотичному веретені всередині клітини [4]. Як і в попередньому випадку, мікротрубочка тут же розбиралася з боку розрізу на плюс-кінці і залишалася стабільною на мінус-кінці. Поведінка останнього досі залишається загадкою, але результати цих експериментів визнали сильним доводом, що підтверджує наявність на зростаючому плюс-кінці мікротрубочки стабілізуючої ГТФ- «шапочки».

Інший важливий аргумент на користь цієї моделі з’явився, коли створили хімічно модифікований ГТФ — дуже схожий на свій прообраз, але практично нездатний до гідролізу. Коли в розчині плавають тільки такі молекули, мікротрубочки добре ростуть, але ніколи не відчувають катастрофи [5]. Така поведінка підтверджує гіпотезу про ДТФ- «шапочку»: її слабогідролізований аналог ніяк не змінюється з часом, а значить, не дозволяє мікротрубочці розбиратися.

Непрямих доказів існування ГТФ- «шапочки» багато, проте її досі не вдалося безпосередньо побачити (хоча такі спроби робилися). Принаймні, оцінили розмір мінімальної структури зі слабогідролізованого аналога ГТФ, якої достатньо, щоб стабілізувати зростання мікротрубочки. Захистити її від розбирання, як виявилося, може «шапочка» всього в один шар дімерів (при цьому реально вона може бути і товщою). Наочний спосіб оцінити кількість ГТФ-дімерів на кінці зростаючої мікротрубочки — додати білок з флуоресцентною міткою, який їх розпізнає. Так званий плюс-кінцевий білок EB1 in vitro світиться на відстані близько сотні шарів тубуліну, причому інтенсивність флуоресценції падає від кінця до тіла мікротрубочки. Якщо цей білок дійсно воліє зв’язуватися саме з ГТФ-дімерами, то подібний розподіл світіння вказує на те, що ГТФ- «шапочка» може бути значно більше одного шару. Примітно, що білок YeV1 яскраво забарвлює кінці зростаючих мікротрубочок, але починає гаснути за кілька секунд перед переходом філамента до катастрофи, ніби відображаючи поступове зникнення стабілізуючої ГТФ- «шапочки» [6]. Виміряна інтенсивність флуоресценції білка EB1 на кінцях мікротрубочок у живих клітинах також свідчить на користь великої (істотно товщої одного шару тубулінів) ГТФ- «шапочки» [7]. Крім мрії мікротрубочок білком EB1, «шапочку» також візуалізували в клітинах за допомогою спеціальних антитіл, що дізнаються ГТФ-тубулін [8]. Цікаво, що вони зв’язувалися не тільки з кінцями мікротрубочок, а й утворювали «острівці» на решті поверхні.

Мікротрубочки старіють?

Модель ГТФ- «шапочки» привернула увагу дослідників насамперед тому, що дозволила пояснити, чому мікротрубочка може стійко рости і вкорінюватися і чому між цими фазами можливі переходи — катастрофи і порятунку.

У 1995 р. Д.Одде (D. Odde) зі співавторами провів простий, але важливий експеримент [9]. Вони спостерігали за зростанням мікротрубочок у пробірці і вирішили побудувати розподіл їхніх довжин. Воно передбачалося експоненційним, але виявилося, що у нього є пік (рис. 3). Значить, на початку зростання мікротрубочки мають дуже маленьку ймовірність випробувати катастрофу, а далі, у міру їх зростання, ця ймовірність підвищується. Якщо перерахувати розподіл довжин мікротрубочок в частоти катастроф, то вийде зростаюча залежність частоти катастроф від часу. Цей ефект назвали «старінням» мікротрубочок — вони ніби «псуються» з часом. Інакше кажучи, «молоді» мікротрубочки можуть рости стабільно, а «старі» вже більш схильні до розбирання. Незвичайний розподіл часів життя мікротрубочок добре апроксимується гамма-розподілом, який характеризує процеси з фіксованою кількістю послідовних кроків. Тому виникла ідея, що найкраще результати проведеного експерименту описує теорія, згідно з якою катастрофа мікротрубочки відбувається за три послідовні стадії, коли в ній накопичилися певні дефекти невідомої природи [10]. Ця гіпотеза, вихідно досить сумнівна, тим не менш істотно підігріла інтерес до дослідження динаміки мікротрубочок на рівні окремих дімерів тубуліну.

Рис, 3. Експериментальний розподіл часів життя мікротрубочок і дві альтернативні апроксимації цих даних

Чого поки не може експеримент і як допомагає теорія?

Виявлений феномен «старіння» мікротрубочок показав, що загальноприйнята модель ГТФ- «шапочки» — деяке спрощення. Дійсно, вона тільки постулює, що мікротрубочка відчуває катастрофу, коли втрачає свій стабілізуючий «ковпачок», але не пояснює, як і чому це відбувається, а також через що ж взагалі мікротрубочка може «старіти». Що за таємничі дефекти накопичуються всередині «старіючої» мікротрубочки, приводячи її до катастрофи? Скільки їх і в якій послідовності вони повинні проявлятися? Може бути, мова йде про гідролізі окремих молекул ГТФ всередині «шапочки» або про якийсь інший процес, залежний від не встановлених поки подій зовсім іншої природи?

Природно, дослідники хотіли б якомога ретельніше розгледіти «живі» мікротрубочки, щоб відповісти на ці питання. Однак сучасний експериментальний арсенал не дозволяє це зробити. Ми можемо або побачити заморожену (знедолену) мікротрубочку з нанометровою роздільною здатністю, наприклад, за допомогою електронного мікроскопа, або простежити динаміку мікротрубочки зі швидкістю сотні кадрів на секунду під оптичним мікроскопом. На жаль, неможливо отримати відповідні дані одночасно, щоб чітко їх співвіднести. Багато в чому з вини таких обмежень сучасній науці невідомо, який точний розмір ГТФ- «шапочки» і як він змінюється з часом, а також яку форму мають кінці мікротрубочок і як вона визначає їх динаміку.

На допомогу експериментам приходять теоретичні методи дослідження, зокрема комп’ютерне моделювання. Воно може відтворити мікротрубочку з дуже високою просторово-тимчасовою роздільною здатністю, правда, ціною неминучих ідеалізацій і спрощень, адекватність яких потрібно ретельно перевіряти (порівнюючи результати модельного і справжнього експериментів). Ідеальна комп’ютерна модель повинна описувати всі наявні експериментальні дані. Тоді на її основі можна буде вивчити механізми спостережуваної поведінки мікротрубочок і передбачити принцип дії білків, що впливають на динаміку цих філаментів в клітинах. Також стане можливим підбір хімічних сполук для управління поведінкою мікротрубочок в медичних цілях.

На сьогоднішній день створено безліч моделей мікротрубочок — від дуже простих до досить складних. Найкращими виявилися найбільш детальні моделі — молекулярні, які враховують, що мікротрубочка складається з багатьох протофіламентів і що її структура дискретна (сукупність окремих суб’єдиниць — тубулінів). Перші такі моделі стали з’являтися майже відразу після виявлення динамічної нестабільності в 1984 р. Працюючи з ансамблем взаємодіючих тубулінів, вони відтворюють поведінку мікротрубочки як цілого. З часів перших молекулярних моделей накопичилося багато нових експериментальних даних про мікротрубочки. Відтоді уточнили їх будову, виміряли нові залежності характеристик росту і вкорочення від різних параметрів, вивчили поведінку цих філаментів після розбавлення тубуліну, оцінили розмір ГТФ- «шапочки», відкрили здатність кінців мікротрубочок розвивати тягучі і штовхаючі сили [11-19]. Це дозволяло коригувати розрахунки і все точніше задавати параметри взаємодії тубулінів. Однак росли і вимоги до моделей, оскільки вони повинні непротиворечиво описувати весь набір наявних експериментальних результатів. Таким чином, способи опису взаємодії тубулінів удосконалювалися і ускладнювалися. Від простих моделей, де суб’єдиниці або взаємодіють один з одним, або ні, перейшли до так званих молекулярно-механічних (найсучасніших і найбільш реалістичних). Вони розглядають молекули тубуліну як фізичні об’єкти, що підпорядковуються законам механіки і рухаються в полі теплових ударінь і потенціалів тяжіння один до одного [20-22]. У ранніх молекулярно-механічних розрахунках динаміки мікротрубочок через обмежену продуктивність комп’ютерів не можна було докладно описати взаємодію тубулінів на основі рівнянь руху і з урахуванням теплових коливань. Однак ця мета залишалася дуже привабливою для нашої команди, оскільки ми припускали, що теплові флуктуації відіграють істотну роль в динаміці мікротрубочок.

Нова молекулярно-механічна модель

Прискорення розрахунків нам вдалося досягти головним чином за рахунок технології паралельних обчислень на найбільшому суперкомп’ютері «Ломоносов» (в обчислювальному центрі МДУ) [23]. Він здатний виробляти 1, 7· ¹⁰15 операцій в секунду, що виводить його на перше місце в Східній Європі за продуктивністю.

Рис, 4. Два дімери тубуліну в молекулярно-механічній моделі. Світло-зеленим кольором зображені лід-мономери, темно-зеленим — лід-мономери. Червоні та сині точки на поверхні мономерів відповідають центрам бокової та поздовжньої взаємодії відповідно

У рамках нашої нової моделі суб’єдиниці тубуліну — це кульки, на поверхні яких розміщені центри взаємодій з «сусідами» (рис. 4). Розглядаються два типи взаємодій — поздовжні і бічні. Самі кульки можуть існувати в двох станах, що відповідають ГТФ- і ГДФ-формам. У першому випадку центри кульок прагнуть вишикуватися вздовж прямої, а в другому — вздовж дуги, що відповідає куті 22 ° (для кожної пари суб’єдиниць). Центри взаємодії притягуються на близьких відстанях і перестають «відчувати» один одного на великих. Рухи кульок описуються рівняннями Ланжевена (наслідками другого закону Ньютона), в яких ми нехтуємо членами, що містять прискорення частинок (оскільки ці складові малі порівняно з іншими). Суб’єдиниці тубуліну, що віддалилися від мікротрубочки на відстань, де вони перестають з нею взаємодіяти, виключаються з розгляду. Також в систему періодично з деякою ймовірністю вводяться нові ГТФ-тубуліни, які з’являються у випадковій позиції на кінці мікротрубочки. Всередині неї вони можуть з певною ймовірністю піддаватися гідролізу — перетворюватися на ГДФ-суб’єдиниці, які тут же хочуть розташуватися по дузі, тобто сформувати вигнутий протофіламент. Але останній необов’язково відразу згинається, оскільки від цього його можуть утримувати бічні зв’язки. Отримана таким чином система взаємодіючих тубулінів еволюціонує в часі: мікротрубочка росте, відчуває катастрофу, вкорачується, рятується і знову подовжується. При цьому наша модель добре описує характерні форми кінців зростаючої мікротрубочок, відтворює спостерігаються в експериментах залежності динамічних характеристик від концентрації тубуліну в розчині, а також феномен «старіння» мікротрубочок. Отже, за допомогою моделювання, виходячи з простих і зрозумілих принципів і без будь-яких екзотичних припущень, ми отримали на екрані комп’ютера віртуальну мікротрубочку — об’єкт, що володіє всіма основними властивостями свого реального прототипу. Розрахувавши координати всіх суб’єдиниць мікротрубочки, ми можемо з безпрецедентною роздільною здатністю і достовірністю дізнатися все про кожен елемент модельної мікротрубочки в будь-який момент часу. Залишається тільки проаналізувати складну послідовність подій у житті мікротрубочки і зрозуміти, які з них і як призводять її до перемикання від зростання до укорачування.

Що ж відбувається з мікротрубочкою перед катастрофою? Спочатку ми з’ясували, чи виконується в нашій моделі будь-якої з двох раніше запропонованих гіпотетичних сценаріїв цієї події. Згідно з одним з них, у структурі мікротрубочки в міру її зростання можуть виникати і зберігатися дефекти, наприклад «дірки» в стінці, що виникають через те, що один з протофіламентів уповільнює або припиняє своє зростання (рис. 5, а) [10]. У нашій моделі немає ніяких штучно вкладених підстав для припинення зростання окремих протофіламентів. Тому така ситуація практично ніколи не реалізується, а отже, не може бути поясненням механізму «старіння» мікротрубочок і виникнення катастроф. Друга гіпотеза говорить, що збільшення схильності мікротрубочки відчувати катастрофи («старіння») відбувається в міру поступового загострення її кінця (рис. 5, б) [24]. Ми ретельно вивчили розкид довжин у протофіламентів мікротрубочки в нашій моделі і з’ясували, що він швидко досягає якоїсь стійкої форми, після чого мікротрубочка залишається з цим рівнем загостреності. Навіть якщо штучно створити конфігурацію мікротрубочки з кінцем, в якому довжини окремих протофіламентів будуть сильно різнитися, то досить скоро зростаюча білкова нитка, надана сама собі, досягне все того ж стійкого рівня загостреності, до якого вона зазвичай прагне. Таким чином, повільне загострення кінця зростаючої мікротрубочки теж не може пояснити феномен її «старіння» в нашій моделі. Ми також звернули увагу, що і розмір ДТФ- «шапочки» не має тенденції поступово зменшуватися (хоча істотно коливається під час зростання мікротрубочки), а значить, він не може бути причиною катастрофи.

Рис, 5. Можливі сценарії «старіння» мікротрубочок. Виникнення катастрофи може відбуватися за рахунок накопичення незворотних дефектів у вигляді протофіламентів (а), що припинили зростати; загострення кінця мікротрубочки (б); виникнення безлічі відігнутих протофіламентів на кінці мікротрубочки (в)

Відсутність явного кандидата на повільний незворотний дестабілізуючий процес призвела нас до думки, що, можливо, його і зовсім немає. А катастрофа відбувається не в результаті повільного накопичення будь-яких дефектів, а через виникнення безлічі короткоживучих звернених подій. Вони час від часу накопичуються на кінці мікротрубочки і тоді призводять її до катастрофи (рис. 5, в). Найбільш ве