Ферментативна реакція Ділса-Альдера: на уроці у Природи

На малюнку зображена гіпотетична схема дії ферменту SpnF. У звужений канал з одного кінця (на малюнку праворуч) потрапляє молекула реагенту (субстрату), а з іншого кінця (ліворуч) виходить молекула продукту, що відрізняється від вихідної молекули реагента наявністю двох додаткових зв’язків (намальовані білим), що замикають цикл. Зображення © Лабораторія В. Ананікова

Довгий час вважалося, що реакція циклоприєднання (реакція Ділса-Альдера) є виключно синтетичним методом органічної хімії і не зустрічається в природі, оскільки не було достовірних доказів існування ферментів, які каталізують такий процес. Цікавою знахідкою виявилася бактерія Saccharopolyspora spinosa: цей мікроорганізм, як з’ясувалося, здатний здійснити внутрішньомолекулярну реакцію циклоприєднання, що дозволяє отримувати поліциклічні біологічно активні продукти. В результаті теоретичного дослідження, виконаного в Інституті органічної хімії імені М. Д. Зелінського РАН (Москва), запропонована модель, що дозволяє пояснити механізм цього унікального процесу. Результати дослідження, опублікованого в журналі PLoS ONE, дають нове уявлення про можливий механізм дії ферментів у таких процесах.

Каталізатори: долаючи бар’єри

Будь — який живий організм у своїй матеріальній основі — це складноорганізована хімічна система, стійке існування якої можливе завдяки величезній безлічі узгоджених один з одним за мільйони років еволюції біохімічних процесів, що протікають в його клітинах або клітці. Щоб вижити, організм повинен реагувати на швидкі умови навколишнього середовища. Для цього потрібно, щоб біохімічні реакції протікали з високою швидкістю.

Як відомо, багато хімічних процесів можуть бути прискорені в багато разів за допомогою спеціальних речовин — каталізаторів, а саме явище такого прискорення називається каталізом. Каталізатор — це речовина, яка спрямовує хімічний процес перетворення субстрату (тобто вихідного реагенту) на продукт по шляху, що вимагає для своєї реалізації менше енергії. В результаті цього і відбувається прискорення реакції порівняно з некаталітичним процесом. Активно беручи участь у хімічній реакції, каталізатор відновлює свою структуру після її завершення і готовий знову виконувати свою прискорюючу роботу. Тобто каталізатори збільшують швидкість утворення продуктів, але не стають їх частиною, а залишаються окремими допоміжними молекулами.

Щоб відбулася хімічна реакція між двома молекулами, ці молекули повинні зіткнутися в просторі. Енергія такого зіткнення може бути різною. Якщо енергії недостатньо для протікання реакції, то молекули так і залишаться у своєму початковому вигляді — у вигляді вихідних реагентів, — не прореагують і не перетворяться на продукти реакції. Якщо ж енергія зіткнення досить висока, то хімічні зв’язки у вихідних молекулах починають розриватися, вся реагуюча система перегруповується, і утворюються молекули продуктів. Мінімальна кількість енергії, яка необхідна для протікання хімічної реакції, називається енергією активації. Ще цю величину називають потенційним бар’єром реакції. Чим більше енергія активації, тим повільніше протікає хімічна реакція, і навпаки — зменшення потенційного бар’єру призводить до прискорення хімічного процесу.

Сам факт наявності енергії активації та її величина безпосередньо визначаються механізмом хімічної реакції, тобто послідовністю станів, через які протікає перетворення реагентів на продукти. На шляху від реагентів до продуктів, як правило, існує проміжний стан, який вже не є реагентом (так як хімічні зв’язки в ньому вже почали розриватися), але ще й не є продуктом (так як нові зв’язки ще не сформувалися в остаточному вигляді), і саме тому енергія такого стану більше як енергії продуктів, так і енергії реагентів. Цей стан називається перехідним станом хімічної реакції (або активованим комплексом). Енергія активації визначається саме енергією перехідного стану реакції і являє собою просту різність між енергією перехідного стану та енергією вихідних реагентів. Така різниця говорить хіміку, скільки потрібно додати енергії в реакційну суміш, щоб реагенти змогли дістатися до найбільш енергетично високої точки — точки активованого комплексу — і, переваливши через цей бар’єр, перетворитися на продукти (рис. 1).

Ріс. 1. Одна з можливих схем, що ілюструють співвідношення енергій реагентів, продуктів і перехідного стану для каталітичної (червона крива) і некаталітичної (синя крива) хімічних реакцій. Зображення © Лабораторія В. Ананікова

Простим і часто використовуваним наочним механічним прикладом перехідного стану і пов’язаної з ним енергії активації є процес вивертання навиворіт відкритої парасольки під дією налетілого пориву вітру. Парасолька в нормальному стані — це «реагент», і, як би ви не крутили в руках цей «реагент», мимоволі він не вивернеться навиворіт, тобто не перетвориться на «продукт». Для такого процесу потрібна додаткова енергія — енергія вітру. Під дією енергії повітряного потоку парасолька вивертається навиворіт, і цей стан «продукту» також стійкий, тому що в ньому наша парасолька може перебувати наскільки завгодно довго, якщо її залишити в спокої, і назад в «реагент» він не перетвориться. Як можна легко здогадатися, «перехідним станом» цього процесу є «пласка парасолька», яка знаходиться на шляху від випуклої парасольки до увігнутого. У цьому плоскому «високоенергетичному» стані парасолька знаходиться лише частки секунди, тому вона і залишається непоміченою, але саме вона визначає ту енергію, яку потрібно витратити на вивертання. І саме воно служить бар’єром, що відокремлює нормальний стан парасольки від вивернутого стану, не даючи можливості відбуватися вивертанню без додаткової енергії і дозволяючи нам користуватися цією річчю.

Слід зазначити, що аналогічні процеси вивертання відбуваються не тільки з парасольками, але і з молекулами, і називаються такі перетворення інверсією. Наприклад, молекула аміаку, що має пірамідальне («зонтичне»), будова може вивернутися навиворіт, пройшовши через плоский перехідний стан, в результаті чого утворюється невідгукнута від первісної молекула NH₃.

Отже, щоб реакція почалася, молекули повинні зіткнутися з достатньою енергією. Для цього частинкам необхідно переміщатися з досить високою швидкістю. Мірою швидкості переміщення молекул служить температура. Тобто чим вище температура суміші, тим швидше переміщуються молекули в ній, а значить, і стикаються вони з більшою енергією. Звідси слід простий висновок: для прискорення хімічної реакції можна просто нагріти суміш. При нагріванні частка «швидких» молекул збільшиться і збільшиться частка результативних зіткнень, тобто актів перетворення реагентів на продукт.

Тоді навіщо ж потрібні каталізатори, якщо прискорювати реакцію можна нагріванням? Відповідь на це питання полягає в тому, що при збільшенні температури почнуть протікати побічні процеси, енергія активації яких виявиться нижчою, ніж у цільового процесу, і ці процеси призведуть до зовсім інших продуктів. Наприклад, при нагріванні складна органічна молекула може розкластися раніше, ніж відбудеться потрібне хімічне перетворення. Особливо важливо це для біохімічних реакцій.

Ферменти — двигуни життя

Відомо, що біологічні молекули, зокрема білки, здатні виконувати свою біологічну функцію лише перебуваючи у певній просторовій формі. Ця форма підтримується відносно слабкими нековалентними взаємодіями (наприклад, водневими зв’язками). Навіть незначне збільшення температури може призвести до того, що потенційний бар’єр розриву цих слабких зв’язків буде подоланий і вони дисоціюють, переставши підтримувати форму білкової молекули. В результаті — неправильне функціонування білків і смерть організму. Саме тому в природі виникли біологічні каталізатори — ферменти, або, як їх ще називають, ензими. Ферменти можуть представляти собою білкові молекули, комплекси білків і нуклеїнових кислот, комплекси білків з металами. Ферменти каталізують біохімічні реакції і дозволяють їм протікати при низьких температурах в живому організмі, забезпечуючи крім цього і потрібну просторову форму продукту, що утворюється, якщо ця форма важлива.

Незалежно від того, в якій області зустрічається каталіз — у неорганічній хімії, органічній хімії або в біохімії, — суть каталізу залишається незмінною і зводиться до зменшення енергії активації реакції за рахунок зменшення енергії перехідного стану (адже саме енергії перехідного стану та вихідних реагентів визначають потенційний бар’єр реакції).

У самих загальних рисах цей процес виглядає так. Каталізатор на першій стадії каталітичної реакції пов’язується з вихідною молекулою реагенту, в результаті чого, як правило, відбувається активація (спрощено кажучи, ослаблення) певних хімічних зв’язків. Такі активовані зв’язки легше формують перехідний стан, а отже, і потенційний бар’єр реакції зменшується. Пройшовши точку перехідного стану, система реагує на продукти, молекули яких від’єднуються від молекули каталізатора. Тобто, завершивши каталітичний цикл, молекула каталізатора знову здатна координувати молекули реагентів, активувати їх і прискорювати процес. У цьому сенсі іноді кажуть, що каталізатор «не витрачається» в ході реакції. У нашому прикладі з парасолькою каталізатор мав би зменшувати жорсткість металевих спиць, щоб зробити легшим перехід у стан «пласку парасольку».

Початок дослідженням ферментативного каталізу було покладено ще в XIX столітті при вивченні процесів бродіння. У 1897 році німецький хімік Едуард Бюхнер (Eduard Buchner) опублікував своє дослідження On alcoholic fermentation without yeast cells (Uber alkoholische Gärung ohne Hefezellen), в якому показав, що для збраження вуглеводів не обов’язково вплив живих дріжджових клітин. Слід зазначити, що до цього ж висновку за 25 років до Бюхнера прийшла наша співвітчизниця Марія Михайлівна Манасеїна. Бюхнер був обізнаний про дослідження Манасеїної, проте посилань на її роботи не давав. (Див.: V. M. Kovalzon, 1994. Maria Manasseina — a forgotten founder of sleep science і В. М. Ковальзон, 2012. Забутий засновник біохімії і сомнології.)

До отримання цих результатів багато вчених вважали, що живі клітини мають особливу «життєву силу», і вона необхідна для роботи ферментів. Завдяки дослідженням Бюхнера і Манасеїної було показано, що ферменти — це каталізатори, дія яких аналогічно дії добре відомих каталізаторів в неорганічній і органічній хімії, і ніякої надприродної «життєвої сили» для ферментативного каталізу не потрібно. У 1907 році за своє відкриття Бюхнер був удостоєний Нобелівської премії з хімії «за дослідження з біохімії та відкриття позаклітинної ферментації» («for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation»).

Пізніше, з розвитком молекулярної біології, з’ясувалося, що функціонування багатьох ферментів всередині клітини все-таки тією чи іншою мірою відрізняється від функціонування у виділеному вигляді. Але пов’язано це з тим, що всередині клітини фермент може зв’язуватися з різними клітинними структурами, що змінює його активність, тоді як в чистому вигляді таких комплексів він, природно, не утворює.

Оскільки молекула ферменту, як правило, значно більша за молекулу субстрату (вихідного реагенту ферментативної реакції), субстрат пов’язується тільки з певною областю молекули ферменту. Така область називається активним центром або активним сайтом ферменту. Активний центр ферменту забезпечує високу селективність ферментативної реакції, так як, завдяки унікальному розташуванню функціональних хімічних груп у своєму складі, він зв’язується тільки з молекулою цільового субстрату, тоді як інші молекули, присутні в клітці, не відчувають споріднення до «чужого» ферменту. Власне, в активному центрі ферменту і відбувається каталітичне перетворення субстрату на продукт. Фермент може не тільки прискорювати протікання реакції, але і за рахунок особливостей будови свого активного центру регулювати просторову форму продукту, що утворюється. Ця здатність ферментів не менш важлива, ніж їх каталітична функція, оскільки біологічна активність багатьох молекул тісно пов’язана з їх просторовою формою.

Як і інші білкові молекули, молекули ферментів утворені послідовністю амінокислотних залишків. У водному середовищі амінокислотна послідовність згортається в глобулярну структуру певним чином, і після цього фермент готовий до виконання своїх функцій. Дані про структуру багатьох ферментів можуть бути отримані за допомогою однієї з баз структурних даних білків, наприклад Protein Data Bank. Наразі відомо 5582 ферменти (див. Enzyme nomenclature database).

Циклоприєднання: від ланцюгів до кільців

До початку 2000-х років накопичилася достатня кількість даних, щоб можна було з упевненістю стверджувати: живі організми здатні у своїх цілях використовувати хімічну реакцію, яка вважалася раніше виключно синтетичним методом, а саме реакцію [4 + 2] циклоприєднання (рис. 2).

Ріс. 2. Схема реакцій [4 + 2] циклоприєднання: (а) — міжмолекулярна реакція, (б) — внутрішньомолекулярна реакція (літерами R і R «позначені в загальній формі органічні заступники). Зображення © Лабораторія В. Ананікова

Реакція циклоприєднання (або реакція дієнового синтезу), вперше описана в 1928 році Отто Ділсом і Куртом Альдером (див. O. Diels, K. Alder, 1928. Synthesen in der hydroaromatischen Reihe и M. B. Smith, J. March, 2007. March’s advanced organic chemistry. Reactions, mechanisms, and structure), в даний час є однією з найбільш широко використовуваних реакцій в синтетичній органічній хімії (J.-A. Funel, S. Abele, 2013. Industrial Applications of the Diels-Alder Reaction). У 1950 році О.Дільс і К. Альдер були удостоєні Нобелівської премії з хімії «за відкриття і розвиток дієнового синтезу» («for their discovery and development of the diene synthesis»).

У найпростішому випадку міжмолекулярної реакції Ділса-Альдера (рис. 2а) відбувається з’єднання молекул етилену (дієнофіл) і 1,3-бутадієна (дієн) з утворенням циклічного продукту — циклогексену. Тобто під час реакції циклоприєднання відбувається з’єднання двох неподільних (які мають ненасичені зв’язки) молекул, що містять 2 і 4 атоми вуглецю, з утворенням циклічного продукту з шести атомів вуглецю. Такий тип реакції циклоприєднання називається [4 + 2] циклоприєднанням (див. cycloaddition). Реакція Дільса-Альдера може бути і внутрішньомолекулярною, що забезпечує її багаті синтетичні можливості. У разі внутрішньомолекулярної реакції дієн і дієнофіл належать одній і тій же молекулі, а їх з’єднання призводить до продукту відразу з кількома циклами — поліциклічному (рис. 2б).

Дієновим синтезом отримують моноциклічні та поліциклічні продукти, які можуть бути як карбоциклічними (тобто містити в циклі тільки атоми вуглецю), так і гетероциклічними (містити в циклі атоми, відмінні від атомів вуглецю: азот, сірку, кисень та інші). Важливість реакції циклоприєднання значною мірою визначається ще й тим, що в результаті не утворюються побічні продукти, тобто в цьому процесі досягається стовідсоткова ефективність «використання» атомів. Даний факт особливо актуальний для розробки екологічно безпечних хімічних технологій в контексті розвитку так званої «зеленої» хімії.

Переважна більшість природних з’єднань містить у своєму складі циклічні фрагменти. Реакція циклоприєднання якнайкраще підходить для отримання циклічних продуктів — як природних, так і штучних.

Синтетична реакція циклоприєднання може бути каталітичною (тоді як каталізатори можуть використовуватися, наприклад, з’єднання ряду металів), але іноді для її проведення не потрібна участь каталізатора, оскільки деякі пари дієн/дієнофіл з’єднуються і в м’яких умовах. Легкість протікання реакції Ділса-Альдера і потреба в каталізі для її проведення залежить від будови дієнів і дієнофілів (в першу чергу від типу заступників при подвійних зв’язках). Але часто в лабораторних умовах такі хімічні перетворення вимагають відносно жорстких умов. Наприклад, високих температур в районі 80-120 ° C, які недосяжні всередині живих клітин (якщо не брати до уваги нечисленні екзотичні випадки гіпертермофільних мікроорганізмів, що мешкають якраз в цьому діапазоні температур). Унікальною особливістю ферментів є їх здатність забезпечувати протікання реакції з високою селективністю при набагато менших температурах.

Циклоприєднання в природі

Незважаючи на широке використання дієнового синтезу в органічній хімії, достовірних відомостей про протікання реакції Ділса-Альдера в живій природі до кінця 1980-х років не існувало. І ось виявилося, що Природа не залишила без уваги цей зручний спосіб отримання циклічних молекул.

У середині 1990-х років було виявлено, що препарати на основі культуральних рідин деяких мікроорганізмів (які аналогічні тим, що використовував Бюхнер у своїх роботах; англійською їх називають cell-free extracts), зокрема грибків Alternaria solani, здатні каталізувати внутрішньомолекулярну реакцію [4 + 2] циклоприєднання з утворенням соланапіронів (solanapyrones) — фітоксинів, виділених у 1983 році (H. Oikawa et al., 1994. First Direct Evidence in Biological Diels-Alder Reaction of Incorporation of Diene-Dienophile Precursors in the Biosynthesis of Solanapyrones и H. Oikawa et al., 1995. Enzymatic activity catalysing exo-selective Diels–Alder reaction in solanapyrone biosynthesis). Ферментативна реакція Ділса-Альдера, яка каталізується ферментом соланапіронсинтазою (solanapyrone synthase), має високу стереоселективність (тобто крім власне прискорення реакції забезпечує і особливу просторову форму продукту), яка важкодосяжна традиційними методами синтетичної органічної хімії.

Після відкриття ферментативного характеру реакції утворення соланапірона була виявлена ще одна ферментативна реакція внутрішньомолекулярного циклоприєднання, в результаті якої утворюється молекула ловастатину (fungal polyketide lovastatin; Див. полікетиди), знайденого в клітинах пліснявого грибка Aspergillus terreus. Зараз у більшості робіт обговорюється механізм утворення ловастатину через стадію циклоприєднання, як найбільш імовірного шляху утворення цього продукту. Фермент, який каталізує реакцію освіти ловастатину, — Lovastatin Nonaketide Synthase, LNKS (див. Полікетідсинтаза) — був виділений в чистому вигляді, і його каталітична активність детально вивчена (D. Witter, J. Vederas, 1996. Putative Diels-Alder-Catalyzed Cyclization during the Biosynthesis of Lovastatin; K. Auclair et al., 2000. Lovastatin Nonaketide Synthase Catalyzes an Intramolecular Diels-Alder Reaction of a Substrate Analogue и E. Stocking, R. Williams. Chemistry and Biology of Biosynthetic Diels–Alder Reactions). Виявилося, що роль LNKS багато в чому полягає у визначенні стереоспецифічності реакції.

Найбільш вивченим ферментом, можливо каталізує реакцію Дільса-Альдера, на сьогоднішній день є виділена з грибків Macrophoma commelinae макрофомат-синтазу (macrophomate synthase), що прискорює міжмолекулярну реакцію циклоприєднання з утворенням макрофомової кислоти (macrophomic acid). Цей фермент, що містить 339 амінокислотних залишків, виділений у вигляді індивідуальної речовини, і його молекулярна структура встановлена рентгено-дифракційним аналізом (цей фізичний метод дослідження дає можливість визначити положення атомів, складових молекулу (див.: T. Ose et al., 2003. Insight into a natural Diels–Alder reaction from the structure of macrophomate synthase; G. Pohnert, 2003. Macrophomate Synthase: The First Structure of a Natural Diels-Alderase и T. Ose et al., 2004. Structure of macrophomate synthase).

Слід зазначити, що всі вищенаведені ферменти каталізують не тільки реакцію Ділса-Альдера, але і деякі перетворення, що передують стадії циклоприєднання.

Спінозін: 4 + 2 = 6

Останнім часом було відкрито ще один фермент — SpnF, який каталізує реакцію [4 + 2] циклоприєднання в процесі утворення спінозину А (Spinosyn A) — тетрациклічного природного інсектициду (рис. 3), що виробляється клітинами бактерії Saccharopolyspora spinosa (H. Kim et al., 2011. Enzyme-catalysed [4+2] cycloaddition is a key step in the biosynthesis of spinosyn A). Цей мікроорганізм був виявлений в ґрунті Віргінських островів в результаті досліджень, що проводяться фармацевтичною компанією Елай Ліллі (Eli Lilly and Company) в 1980-х роках (F. Mertz, R. Yao, 1990. Saccharopolyspora spinosa sp. nov. Isolated from Soil Collected in a Sugar Mill Rum Still).

Спінозини — це цілий ряд сполук, в основі яких лежить тетрациклічна структура, доповнена вуглеводними заступниками (H. Kirst, 2010. The spinosyn family of insecticides: realizing the potential of natural products research). Такі структури називаються макролідами. За своєю біохімічною природою спінозин являє собою вторинний метаболіт, а більшість вторинних метаболітів проявляють антибактеріальну активність (тобто є антибіотиками). Однак з’ясувалося, що спінозин, вироблений клітинами Saccharopolyspora spinosa, на відміну від інших макролідів не володіє вираженою антибактеріальною активністю, але проявляє інсектицидну активність, що нехарактерно для макролідних антибіотиків (H. Kirst et al., 1991. A83543A-D, Unique Fermentation-Derived Tetracyclic Macrolides). Тому спінозин швидко знайшов застосування саме в якості інсектициду.

Порівняно з іншими інсектицидами, спінозини швидко розкладаються в навколишньому середовищі, виявляють більшу селективність щодо комах-шкідників і меншу токсичність по відношенню до ссавців і мешканців водойм (B. Yano et al., 2002. Spinosad Insecticide: Subchronic and Chronic Toxicity and Lack of Carcinogenicity in Fischer 344 Rats).

Ріс. 3. Структура молекули спінозину А. Виділена область поліциклічної системи, що утворюється в результаті реакції Ділса-Альдера. Ріс. з обговорюваної статті в PLoS ONE з адаптацією © Лабораторії В. Ананікова

У клітині бактерії спочатку відбувається синтез попередника спінозину (рис. 4, структура 1), який є макроциклічною структурою зі зв’язаними подвійними зв’язками (тобто такими, що чергуються з простими зв’язками).

Схема синтезу молекули Спінозіна А’) «>

Ріс. 4. Синтез молекули спінозину А відбувається в результаті реакції Ділса-Альдера. Ріс. з обговорюваної статті в PLOS ONE

Якщо уважно подивитися на структуру попередника і порівняти зі схемою на рис. 2, то стане ясно, що внутрішньомолекулярна реакція [4 + 2] циклоприєднання є найбільш оптимальним способом для отримання поліциклічної основи спінозину А. У структурі попередника можна виділити дієнову частину (пофарбована синім кольором) і дієнофільну частину (пофарбована червоним кольором). Реакція циклоприєднання між цими фрагментами призводить до структури проміжного продукту (2) і саме ця стадія каталізується ферментом SpnF. Після цього структура (2) в результаті ряду перетворень (позначених подвоєною стрілкою) знаходить вуглеводні заступники і приймає остаточну форму молекули спінозину. Серед усіх цих перетворень найбільший інтерес дослідників приваблює саме стадія циклоприєднання, тобто переходу зі структури (1) в (2), тому що в природі реакція [4 + 2] циклоприєднання зустрічається надзвичайно рідко.

SpnF — фахівець з циклоприєднання

Інтерес саме до цієї реакції обумовлений ще й тим, що на відміну від перерахованих вище ферментів, які каталізують крім циклоприєднання і ряд інших процесів, SpnF регулює хід виключно реакції Ділса-Альдера, тобто Природа «придумала» спеціальний фермент тільки для цього процесу.

Механізм дії ферменту SpnF досі невідомий. Однак розкриття цього механізму може мати фундаментальне значення для розширення наших уявлень про ферментативний каталізі. Чим же може бути примітна робота ферменту SpnF?

При описі роботи ферментів (які не обов’язково каталізують процес циклоприєднання) прийнято вважати, що їх каталітична роль полягає в розбитті однієї стадії з високою енергією активації на послідовність декількох стадій з меншою енергією активації (рис. 5, зліва).