Кремнієві нанотехнології «в пробірці»

Кремній — один з найбільш широко поширених хімічних елементів у земній корі — не входить до числа основних елементів, що складають живі клітини, а у високих концентраціях навіть токсичний. Проте багато організмів, від губок і радіолярій до злаків, активно використовують його для створення каркасних елементів свого тіла. Серед найбільш майстерних творців структур з полімеризованого кремнезему — численна і широко поширена група діатомових водоростей. У своїх «кремнієвих нанотехнологіях» ці мікроводорості не використовують екстремально високі температури і «важку хімію», тому вони служать об’єктом пильної уваги сучасних біотехнологів.

Про авторів

Вміння діатомових водоростей майстерно маніпулювати кремнієм, яке еволюціонувало і «оптимізувалося» десятки мільйонів років, в епоху високих технологій викликає жвавий інтерес вчених. Термін «діатомові нанотехнології» (diatom nanotechnologies) ввів ще в 1988 р. американський дослідник Р. Гордон (Gordon, Aguda, 1988). Зараз стосовно всієї групи пігментованих гетероконтів, до яких належать не тільки діатомеї, але і хризофітові, можна говорити про кремнієві нанотехнології (silicon nanotechnologies) в широкому сенсі (Grachev et al., 2008). Тому не дивно, що макро- і мікропроцеси морфогенезу і сама структура кремнеземних створок водоростей привертають сьогодні увагу фахівців з різних областей.

Завдяки своїм оптичним властивостям і великій площі поверхні, на якій можуть бути іммобілізовані антитіла і ферменти, панцирі діатомів можуть використовуватися в якості біосенсорів (Gale et al., 2009; Sheppard et al., 2012). Нещодавно була показана можливість їх застосування для цільової доставки погано розчинних у воді лікарських препаратів, наприклад, антиракових (Delalat et al., 2015).

Панцирі діатомей є і об’єктом трибології — науки, що досліджує контактні взаємодії твердих деформованих тіл при їх відносному переміщенні. При цьому особливу увагу привертають способи об’єднання клітин водоростей у колонії за допомогою сполучних кремнеземних конструкцій і адгезивних речовин, які вони виділяють (Кроуфорд, Гібшубер, 2006, Gebeshuber, 2007). Діатомеї могли б стати і економічною заміною таких нанотехнологій, як планарна літографія, яка використовується для створення «плоских» напівпровідникових приладів, інтегральних мікросхем, а також деяких надпровідникових наноструктур. Один з етапів цієї технології — формування в чутливому шарі на поверхні підкладки рельєфного малюнка, що повторює топологію мікросхеми. От якби діатомеї можна було «замовити» конкретний малюнок!

Панцир діатомеї складається з двох створок, що перекриваються, з’єднаних один з одним подібно мильниці, що з’єднують створки пояскових ободків

Ця мрія хвилює багатьох — її реалізація могла б стати основою принципово нових біотехнологічних виробництв. Однак незважаючи на всю можливу користь і економічну вигоду, ми ще далекі від повного розуміння генетичних і клітинних процесів, що лежать в основі морфогенезу кремнеземного панцира діатомей, хоча ці дослідження ведуться з середини минулого століття.

Серед усіх одноклітинних організмів, що створюють неорганічні структури мікро- і нанорозміру, діатомові водорості відрізняються особливим різноманіттям форм. За типом симетрії панцирів діатомеї поділяються на три основні групи: центричні з радіальною і біполярною симетрією (найдавніша група) і пеннатні з білатеральною симетрією. Пеннатні, в свою чергу, підрозділюються на шовні і безшовні за наявністю або відсутністю щілини на створці.

Діатомеї з різними типами симетрії панцирів: а — центрична діатомея Stephanodiscus sp. радіальною симетрією; — пеннатна безшовна діатомея Fragilariavausheriae var. capucina з білатеральною симетрією; в — пеннатна шовна діатомея Achnantidium sibiricum з білатеральною симетрією

Ключова ланка — мікротрубочки

Кремніста створка діатомових водоростей формується в спеціалізованій внутрішньоклітинній органелі — везикулі відкладення кремнезему, оточеній специфічною мембраною — силікалемою. На сьогодні відомо, що важливу роль у формуванні створки відіграє цитоскелет, зокрема, мікротрубочки, які у деяких видів діатомів вдалося візуалізувати за допомогою флуоресцентної та конфокальної мікроскопії. В експериментах, де використовувалися речовини, що інгібують роботу мікротрубочок (колхіцин, люміколхіцин, орізалін та ін.), водорості формували створки з різноманітними аномаліями.

Пари сполучених створок сестринських клітин Cymatoseira. Фото: Р. М. Кроуфорд, І. Гібшубер

У відділі ультраструктури клітини Лімнологічного інституту СО РАН була вперше в світі досліджена роль цитоскелета в морфогенезі створки на синхронізованій культурі діатомових водоростей, де всі клітини знаходяться на одній і тій же стадії клітинного циклу. Домогтися синхронізації клітинних культур діатомей порівняно нескладно: для цього достатньо утримувати їх деякий час у безкремнієвому середовищі. Клітини спочатку будуть посилено витрачати свій запасений кремній на побудову панцира, а як тільки він весь витрачається, вони перестануть ділитися і зупиняться на певній стадії життєвого циклу. При додаванні кремнію в середу клітини знову починають процес формування нових створок і ділення.

Діатомова водорость Synedra acus. Світлова мікроскопія

Схема роботи мікротрубочок і паклітаксела. По: (Dumontet, Jordan , 2010)

«Піддослідною» стала діатомея Synedra acus subsp. radians — ця водорость протягом декількох років служить в ЛІН ЗІ РАН модельним об’єктом при вивченні всіх аспектів морфогенезу створки і добре розмножується в лабораторній культурі. В експериментах використовувалися два інгібітори роботи мікротрубочок з різним механізмом дії — колхіцин і, вперше, паклітаксел. Колхіцин блокує збірку нових мікротрубочок, зв’язуючись з їх зростаючими кінцями. Мікротрубочки, які зазнали деполімеризації, вже не можуть відновитися і незабаром руйнуються; при видаленні колхіцину з середовища вони відновлюються. Паклітаксел, навпаки, блокує деполімерізацію мікротрубочок, зв’язуючись з білком лід-тубуліном, що викликає утворення пучків мікротрубочок.

Експерименти на синхронізованій культурі синедри показали, що додавання колхіцину в певний момент морфогенезу дозволяє отримати нові кремнеземні форми з певною структурою (Kharitonenko et al., 2015). Так, найбільша кількість створок з нерівномірними і непараллельними рядами ареол (отворів) зустрічається при додаванні колхіцину через 1,5 години після початку морфогенезу створки, а найбільша кількість викривлених створок — через 0,5 години. Найцікавіше — створки без ареол з’являються, тільки якщо додати колхіцин через 2,5 години після початку морфогенезу! Це справедливо і щодо паклітаксела, причому при використанні обох цих інгібіторів частка створок з аномаліями і характер змін їх морфології залежить від стадії морфогенезу, на якій інгібітори додають в середу з культурою водорості.

У синхронізованій культурі клітин пеннатної безшовної діатомової водорості Synedra acus при додаванні колхіцину і паклітаксела збільшується частка клітин з різними аномаліями будови кремнеземного панцира. У разі паклітаксела спостерігаються і такі рідкісні аномалії, як великі отвори в створці. Просвічуюча та скануюча електронна мікроскопія

Однак вплив паклітаксела призводить до появи і таких аномалій у будові створки, які не спостерігаються у разі застосування колхіцину. Серед них — великі отвори в створці (поодинокі випадки), а також розширення створки, що досить часто зустрічається при використанні паклітаксела на початкових стадіях морфогенезу.

Як з «стаканчика» зробити «трубочку»

У культурі клітин центричної діатомової водорості Aulacoseira islandica при додаванні колхіцину з’являються зрослися дочірні створки, їх кремнеземний панцир набуває вигляду «мікротрубочки» замість типового для цього виду «мікростаканчика». Вгорі: створки без лицьової частини. Конфокальна мікроскопія

Співробітниці ЛІН СО РАН Надії Волокітіній вдалося виділити в лабораторну культуру ще один вид діатомових водоростей — Aulacoseira islandica, що домінує в байкальському фітопланктоні в певні сезони. Морфогенез цієї діатомеї, на відміну від синедри, порівняно мало вивчений. У представників роду Aulacoseira створка завдяки своєму надзвичайно високому загину нагадує «мікростаканчик», а клітини в колоніях міцно скріплені особливими сполучними шипами.

Оскільки цей вид має тонкий панцир, який зминається і розривається при маніпуляціях, при оцінці впливу інгібіторів на його морфогенез було вирішено використовувати спеціальний флуоресцентний барвник, який вбудовується в створки, що формуються, і дозволяє спостерігати за результатом експериментального впливу в конфокальний мікроскоп.

За допомогою цієї технології вдалося показати, що в присутності колхіцину в культурі з’являються зрослися дочірні створки без перегородки, тобто «мікростаканчики» перетворюються на «мікротрубочки». Таким чином, якщо клітці на певній стадії морфогенезу завадити спорудити «донечко» (лицьову частину створіння), то вона згодом продовжить будувати загин створки за запрограмованим сценарієм, як якщо б будівельники з якоїсь причини не побудували фундамент будівлі, а наступна бригада продовжила зведення стін або даху.

Вгорі: нормальні «стаканчики» — очищені кремнеземні створки A. islandica. Світлова мікроскопія. Внизу: 3D-зображення нормальної створки Aulacoseira islandica. Конфокальна мікроскопія

Вгорі: жива колонія A. islandica з лабораторної культури. Світлова мікроскопія. Внизу: 3D-зображення нормальної створки Aulacoseira islandica. Конфокальна мікроскопія

Сьогоднішні дослідження механізмів формування створок у діатомових водоростей дозволять у майбутньому використовувати ці кремнієві біонанотехнології на благо людства, хоча зараз ми знаходимося лише на самому початку цього довгого шляху. Не виключено, що подальше вивчення регуляції роботи мікротрубочок цитоскелета діатомей на клітинному і генетичному рівнях дасть можливість отримувати культури мутантних водоростей і «на замовлення» створювати кремнеземні структури з потрібними характеристиками.

У публікації використані фото авторів

Література1

. Кроуфорд Р. М. Гібшубер І. Міні-наноінженери//Наука з перших рук. 2006. № 4 (10). С. 48-54.2.

Delalat B., Sheppard V. C., Ghaemi S. R. et al. Targeted drug delivery using genetically engineered diatom biosilica // Nature Communications. 2015. № 6.3.

Dumontet C., Jordan M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics // Nat. Rev. Drug Discov. 2010. V. 9. P. 790–803.4.

Gale D. K., Gutu T., Jiao J., Chang C.-H., Rorrer G. L. Photoluminescence detection of biomolecules by antibody-functionalized diatom biosilica // Advanced Functional Materials. 2009. V. 19. P. 926–933.5.

Gebeshuber I. Biotribology inspires new technologies // Nano Today. 2007. V. 2. № 5. P. 30–37.6.

Gordon, R. & B. D. Aguda. Diatom morphogenesis: natural fractal fabrication of a complex microstructure // Harris, G. & C. Walker, Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Part 1/4: Cardiology and Imaging, 4–7 Nov. 1988, New Orleans, LA, USA, New York: Institute of Electrical and Electronics Engineers. 1988. V. 10. P. 273–274.7.

Grachev M. A., Annenkov V. V., Likhoshway Ye. V. (2008) Silicon nanotechnologies of pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. V. 30. P. 328–337.8.

Sheppard V. C., Scheffel A., Poulsen N., Kröger N. Live diatom silica immobilization of multimeric and redox-active enzymes // Appl. Environ. Microbiol. 2012. V. 78. № 1. P. 211–218.