Людина не винна

Актинії Metridium. Фото: Надія Санам «ян

Авачинська бухта на Камчатці — друга за розміром бухта у світі після Сіднейської. Прекрасне місце для дайвінгу і для любителів серфінгу. Тут на кожному камені мешкали десятки тварин. Актінієві сади змінювалися лугами, на яких паслися морські їжаки. По дну повзали волохаті та кам’яні краби, а також раки-відлюдники. Туди-сюди метушилися фіолетово-рожеві холодноводні креветки. Тут мешкали 32 види риб, у тому числі камбала, бички, терпуги. У бухті жили нерпи, сюди заходили сивучи і касатки.

Восени 2020 року води Авачинської бухти спорожніли. На дні всюди лежали мертві поліхети — багатощетинкові хробаки, яких зазвичай не видно: вони ховаються серед водоростей. Зникли риби. У морських їжаків випали голки. Загинули губки, актинії, двостворчасті молюски…

Що ж вбило біосферу затоки? Раптова масова загибель морських організмів в Авачинській бухті негайно викликала підозру екологів: винна людська діяльність! Витік рідких радіоактивних відходів з підземного сховища? Ракетне паливо (несиметричний диметилгідразин) і продукти його розпаду, через підземні води винесені в океан? Нафтопродукти, що пролилися з корабля, що проходив повз?

Починаємо з води

Після того як звістка про екологічну катастрофу на Камчатці широко поширилася, до Москви з постраждалого району привезли 20 проб води. У лабораторіях провели аналізи в пошуках нафтопродуктів, ракетного палива і радіоактивних речовин. Були виявлені феноли (ознака розливу нафти), але в концентрації, недостатній для масової загибелі живих організмів.

В одній з 20 проб знайшли сліди окислення одного з головних токсичних компонентів ракетного палива — несиметричного диметилгідразину. Однак робити висновки про отруєння ракетним паливом було б передчасно, тому що несиметричний диметилгідразин при окисленні утворює величезну кількість сполук, а в тій єдиній пробі виявили тільки два з них, причому не найстійкіші: тетраметилтетразен і нітрозодиметиламін. Більш того, останній може бути продуктом розкладання багатьох органічних речовин, тому необов’язково має антропогенне походження.

Після першого аналізу питання залишилися без відповідей. Щоб прийняти або відкинути антропогенні версії, потрібні були додаткові дослідження.

Креветка Lebbeus polaris. Фото: Надія Санам «ян

Спускаємося на дно

Через кілька днів на Камчатку вирушила експедиція телеканалу Life. Дайвери зібрали зразки загиблих бентосних організмів: морських їжаків, крабів і раків-відлюдників. Потім автор фільму «Отруйний океан» Олександра Лі приїхала в ІФХЕ РАН і попросила перевірити ці зразки на нітрозодиметиламін і диметилгідразон формальдегіду. Якби ці речовини були знайдені в пробах тканин, отруєння ракетним паливом можна було б вважати доведеним.

Зразки надійшли до лабораторії фізико-хімічних основ хроматографії та хромато-мас-спектрометрії ІФХЕ РАН.

Від проби до мас-спектру

Прилади — хромато-мас-спектрометри — працюють або з рідкими, або з газоподібними пробами. Проби надійшли в ІФХЕ РАН у замороженому вигляді. Тут їх заморозили ще сильніше, заливши рідким азотом. При мінус 196 ° С проби стали крихкими, і зразки перетерли в порошок в хімічній ступці.

Наступний етап — екстракція органічних речовин. Під час цього процесу речовини переводять у розчинник, що не змішується з водою. Досвідчений дослідник вміє вибрати розчинник, який найкращим чином екстрагує речовину. Для посилення екстракції використовуються ультразвукові ванни, куди залитий розчинником зразок розміщується на годину або дві.

Потім, щоб остаточно відокремити розчин від осаду, отриману суміш поміщають в центрифугу. Після центрифугування розчин був введений в газовий хроматограф з мас-спектрометричним детектором. Були зареєстровані хроматограми — графіки з великою кількістю піків, де кожен пік відповідає якомусь окремому хімічному сполуку. Для кожного піку був отриманий свій мас-спектр, і по ньому за допомогою бібліотеки, що містить понад 300 тис. сполук, визначено хімічну сполуку та її структуру.

Що таке хромато-мас-спектрометрія

Хромато-мас-спектрометрія — на сьогоднішній день найбільш точний спосіб визначити, з яких речовин складається суміш. Для цього суміш пропускають через хроматографічну колонку, заповнену речовиною-адсорбентом. Адсорбент уповільнює рух компонентів суміші, але для різних молекул ступінь цього уповільнення відрізняється. У підсумку молекули різного складу, як бігуни в масовому забігу, в різний час приходять до фінішу — виходу з колонки. Завдання хроматографіста-дослідника — знайти специфічні адсорбенти, щоб краще розділити молекули.

Потім мас-спектрометр іонізує молекули (при цьому складні молекули частково руйнуються, і тоді аналізуються їх фрагменти, що розширює можливості з визначення структури речовини), розганяє їх в електричному полі у вакуумі, а потім поміщає в магнітне поле. У магнітному полі іони з різним співвідношенням маси до заряду рухатимуться по-різному. Далі стоїть детектор, який реєструє кількість іонів, що дісталися до мети в той чи інший момент часу. Таким чином визначається відношення маси молекули до її заряду. Результати представляються у вигляді графіка розподілу іонів за їх масовими числами. Графік виглядає як низка вертикальних ліній різної висоти і нагадує лінійчастий спектр. Через це графічне уявлення метод отримав назву «мас-спектрометрія», хоча більше нічого спектрального в ньому немає.

Мас-спектр для молекули так само унікальний, як відбиток пальців для людини, і, бачачи мас-спектр, можна точно сказати, якій речовині він відповідає. Якщо, звичайно, цей мас-спектр є в картотеці (тобто в базі даних, або, як прийнято говорити, в бібліотеці мас-спектрів).

Мас-спектрометрія дуже чутливий метод і дозволяє виявити сполуки в слідових концентраціях — кілька молекул на мільярд. Така концентрація не змінює ні колір, ні запах, ні прозорість розчину. Але при цьому вона може чинити негативний (або позитивний) вплив на живих істот.

Свіжого нафтового отруєння не виявлено

Найцікавіші результати були отримані при вивченні морських їжаків.

У розливу нафти є характерні ознаки у вигляді сполук вуглеводнів: летючі і швидко біорозкладаються n-алкани (c S₇ по C₄₀) і більш стійкі стерани, терпани і гопани. Гопани найдовше без змін зберігаються в тканинах живих організмів.

На хроматограмах, отриманих при дослідженні тканин морських їжаків, були виявлені піки, характерні для гопанів. Стерани і терпани в тканинах морських їжаків виявлені не були.

У разі свіжого розливу нафти хроматограма розподілу по n-алканах повинна мати специфічну форму дзвону. Однак отримана хроматограма по алканах мала інший вигляд. У всіх зразках були знайдені алкани C₁₅ і S₁₇, але ці компоненти часто мають природне походження, зустрічаються в морському фітопланктоні і з великою ймовірністю потрапили в донні організми неантропогенним шляхом.

Отже, виявлені в тканинах морських їжаків сліди нафтового забруднення вже метаболізовані тваринами. Це свідчить про давнє нафтове отруєння їжаків, що носило хронічний, а не катастрофічний характер. Морські їжаки вже довго вбирали нафту.

Також аналіз показав, що антропогенні вуглеводні майже повністю відсутні в біологічному матеріалі крабів і раків-відлюдників. Така відмінність між зразками морських їжаків і ракоподібних може бути обумовлена їх різним способом життя і трофічними ланцюгами.

Отримуйте бичок Гілберта Hemilepidotus gilberti. Фото: Надія Санам «ян

Важкі метали в нормі

Іншим маркером нафтового забруднення є присутність важких металів (кадмію, свинцю, нікелю, цирконію, ванадію, цинку) в тканинах живих організмів. Методом мас-спектрометрії з індуктивно пов’язаною плазмою було вимірено вміст металів з усієї таблиці Менделєєва (від літію до урану).

Робити висновки складно, тому що вміст металів в тканинах донних тварин камчатської акваторії раніше не вивчався і тому нормальний вміст металів для них не визначено. Довелося порівнювати результати з результатами, отриманими для близьких видів тварин, що мешкають в інших місцях. З’ясувалося, що вміст металів, за винятком алюмінію, в гонадах морських їжаків не перевищує норми. У тканинах краба тільки концентрація кадмію знаходиться біля верхньої межі допустимої норми, для інших металів концентрація в межах норми. Тому можна сказати, що тест на присутність важких металів не вказує на недавнє нафтове отруєння.

Ракетне паливо і радіоактивні відходи не виявлені

Результати не вказують на присутність несиметричного диметилгідразину, а також найстійкіших продуктів його окислення з групи тріазолів. Також не виявлено те, що просили пошукати представники каналу Life, — нітрозодиметиламін або диметилгідразон формальдегіду. Хоча на морських мешканцях експерименти з несиметричним диметилгідразином не проводилися, є роботи, що показують, що у ссавців диметилгідразин, потрапивши на шкіру, швидко всмоктується в загальний кровотік і протягом довгого часу визначається в тканинах. Тому якби ракетне паливо потрапило в морську воду, його компоненти були б присутні в тканинах тварин. Але вони виявлені не були. Також не було виявлено слідів радіоактивних речовин.

Dermaturus mandtii (вигляд ракоподібних). Фото: Надія Санам «ян

Подальші дослідження

Результати дозволяють сказати: це була не нафта. Це було не ракетне паливо. Це були не радіоактивні відходи. Тварини в Авачинській бухті загинули через щось інше.

Вперше хроматографісти ІФХЕ РАН, дослідивши причини масової загибелі тварин на Камчатці, виключили три найбільш обговорювані антропогенні причини. Результати досліджень були опубліковані в лютневому номері журналу Marine Pollution Bulletin за 2021 рік.

«Ми готові і далі працювати в цьому напрямку, — заявив директор ІФХЕ РАН, член-кореспондент РАН Олексій Буряк, — наприклад, разом з біологами шукати сліди якихось специфічних речовин, які будуть маркером для біогенної причини того, що сталося. Або продовжити контроль за вмістом вуглеводнів і металів в тканинах морських організмів, перевіряючи, як йде відновлення біосреди і чи не з’являється якась нова невидима загроза. Тепер, коли перші вимірювання проведені, у нас є точка відліку і заділ на майбутнє. У хромато-мас-спектрометрії з її чутливістю і точністю воістину безмежні можливості з виявлення та попередження екологічних катастроф «.