Не чекати милостей від еволюції

Людина, як і всі мешканці планети Земля, з’явилася завдяки еволюції. А наприкінці ХХ століття він сам навчився її використовувати. І гаразд би для створення живих істот — для кращого протікання хімічних реакцій! У 2018 році хімікам, які першими направили еволюцію білків у потрібний бік і отримали молекули, які могли б і не утворитися в ході неспішної біологічної еволюції, присуджено найвищу наукову нагороду сучасності. Лауреатами Нобелівської премії з хімії 2018 року стали Френсіс Арнольд (Каліфорнійський технологічний інститут, США), Джордж Сміт (університет Міссурі, США) і сер Грегорі Вінтер (Кембриджський університет, Великобританія). Білки-каталізатори — ферменти, створені за допомогою спрямованої еволюції, — сьогодні беруть участь у виробництві відновлюваного біопалива, синтезі лікарських препаратів і вирішують безліч інших завдань. Білки-антитіла, отримані за допомогою особливого підходу під назвою «фаговий дисплей», борються з аутоімунними та онкологічними захворюваннями.

Одна з наймогутніших сил у Всесвіті — еволюція. Завдяки їй за чотири мільярди років життя поширилося по всій Землі, і в будь-якому її куточку, від «чорних курців» — підводних гідротермальних джерел — до полярних снігів, мешкають живі організми, пристосовані саме до таких умов. Пристосованість забезпечують постійну появу випадкових мутацій і природний відбір, що зберігає вдалі варіанти. Або, на молекулярному рівні, — поява білків, що забезпечують найбільш ефективну взаємодію рослин і тварин з середовищем їх проживання. Десять тисяч років людство застосовує штучний відбір, виводячи нові сорти рослин і породи тварин. Можна сказати, що вже з неолітичної революції люди оптимізували властивості ферментів та інших функціональних білків, правда, більшу частину часу вони не знали, що займаються селекцією і генетикою мікроорганізмів, а просто варили пиво і пекли хліб.

Для багатьох з нас природний і штучний відбори асоціюються з біологією, але давайте подивимося на них очима хіміка. Існування життя на Землі можливе завдяки тому, що еволюції вдалося вирішити цілу низку складних хімічних завдань. Всі живі організми здатні витягувати речовини та енергію з навколишнього середовища. Так, мешканці полярних широт можуть протистояти низьким температурам за допомогою білків-антифризів (див. «Хімію і життя» № 12, 2016). Білки бактерій з гарячих джерел не денатурують при температурах вище 90 ° С. Прибої молюски, що живуть у смузі, прикріплюються до скель за допомогою білкового клею, що відмінно працює у воді. Список білкових молекул з унікальними властивостями, що з’явилися завдяки природному ходу біологічної еволюції, можна продовжувати нескінченно.

До кінця ХХ століття, коли біологи і хіміки вже були досить обізнані про те, якими маршрутами протікає біологічна еволюція, виникла ідея прискорити появу білків з бажаними властивостями — перенести їх еволюцію в лабораторії, де її можна було б підштовхувати в потрібному напрямку.

Направляється людиною еволюція ферментів (Френсіс Арнольд) або антитіл (Джордж Сміт і сер Грегорі Вінтер) — багаторазово повторюваний процес, який включає визначення будови білка, внесення змін до його ген, експресію зміненого білка і скринінг — відбір на потрібні властивості серед різноманітних мутантів. Наприклад, якщо цей білок — фермент, що розкладає якусь речовину, шкідливу для бактерії, гени білка впроваджують у бактеріальні клітини, а речовину додають у середовище, на якому бактерії ростуть. Очевидно, що найкращі ферменти синтезують ті бактерії, які вижили. Після цього все повторюється з відібраними білками і їх генами до тих пір, поки в черговому раунді новий білок не продемонструє бажаний рівень ферментативної активності, специфічності або міцності пов’язування з антигеном.

Зліва направо: сер Грегорі Вінтер, Джордж Сміт, Френсіс Арнольд

Найкраще з того, що є

Половина Нобелівської премії 2018 року присуджена професору Каліфорнійського технологічного інституту Френсіс Арнольд за роботи в галузі спрямованої еволюції ферментів. Однак історія рукотворних біологічних каталізаторів почалася за десятиліття до першої публікації Арнольд в цій області. У 1984 році Манфред Ейген (який розділив з Рональдом Норрішем і Джорджем Портером Нобелівську премію з хімії 1967 року за вивчення надшвидких хімічних реакцій) опублікував теоретичну роботу, в якій вперше припустив, яким чином можна буде здійснити спрямовану еволюцію ферментів (Pure and Applied Chemistry, 1984, v. 56 (8), 967. Зауважимо, що загальними питаннями еволюції біомолекул Ейген цікавився і раніше, див., наприклад, статтю М. В. Волькенштейна в «Хімії і життя» (№ 8, 1974). У статті 1984 року Ейген вказував, що оптимізація властивостей ферментів буде цікавим і складним завданням, оскільки генотип і фенотип визначаються різними молекулами. Він припускав, що від великих бібліотек ферментів і генів, що відповідають за їх експресію, толку буде небагато — в них важко, якщо взагалі можливо, знайти ферменти, що працюють ефективніше природних. Ейген запропонував використовувати невеликі бібліотеки ферментів, що формуються за кілька послідовних поколінь мутагенезу, і передбачив, що рано чи пізно з’явиться можливість створення «еволюційної машини», діючої методом покрокового наближення, яка і дозволить отримувати ферменти з оптимізованою структурою і властивостями.

Дев’ятьма роками пізніше Френсіс Арнольд опублікувала першу експериментальну роботу, що описувала успішну спрямовану еволюцію ферменту в лабораторії (PNAS USA, 1993, 90 (12), pp. 5618-5622). Це був субтилізин Е — фермент класу гідролаз, що каталізує гідроліз білків і пептидів, а також складних ефірів і амідів N-захищених амінокислот. Френсіс Арнольд отримала версію субтилізину, що зберігала активність в денатуруючому оточенні — у водних розчинах, що містять високі концентрації диметилформаміда (ДМФ). Через чотири етапи випадкового мутагенезу з подальшим визначенням каталітичної активності мутантних білків у присутності ДМФ з’явився фермент, активність якого в 60% -вому розчині ДМФ була в 256 разів вище, ніж у природного субтилізину Е.

Так вперше вдалося показати, що при поліпшенні природних ферментів простіше покладатися на випадкові мутації і ретельний відбір білків, властивості яких випадково ж змінилися в потрібний бік, ніж намагатися отримувати нові ферменти, контролюючи кожен етап їх синтезу. Внесення фактора випадковості стало першим і найбільш важливим кроком до отримання модифікованих ферментів з необхідними властивостями.

Наступний крок зробив Віллем Штеммер, дослідник з Нідерландів (Штеммер помер у 2013 році, інакше він би теж міг претендувати на частину премії). Він запропонував використовувати для еволюції ферментів стратегію рекомбінації ДНК, яку назвав ДНК-шафлінгом, або перетасовуванням ДНК (Nature, 1994, v. 370, pp. 389-391). Ноу-хау Штеммера дозволяло швидше отримувати вигідні мутації, збільшуючи розміри бібліотеки за рахунок рекомбінації фрагментів функціонально схожих генів, узятих у декількох організмів. Штеммер зі співавторами використовував перетасовки ДНК для збільшення активності ферменту бета-лактамази, який у бактерій відповідає за стійкість до антибіотиків з групи бета-лактамів. Незабаром після публікації роботи Штеммера метод почали використовувати і в лабораторії Арнольд, і до другої половини 1990-х років вона і Штеммер стали «законодавцями мод» у цій галузі.

До кінця минулого століття спрямована еволюція ферментів значно спростилася — отримувати бібліотеки білків-каталізаторів стало легше, оскільки маніпуляції з ДНК ставали все дешевшими. Каталітична активність ферментів значно перевершувала активність каталізаторів, створених у лабораторіях; крім того, до кінця ХХ — початку XXI століття в синтетичній каталітичній хімії з’явилася тенденція до розробки методів синтезу речовин без каталізаторів на основі перехідних металів. Тому роботи Арнольд і її послідовників швидко набували практичного значення. Спрямовану еволюцію ферментів стали використовувати не тільки для проведення вже відомих реакцій в екзотичних умовах, але і для створення білків, здатних каталізувати хімічні реакції, що не існують в природі. Багато з таких реакцій не просто протікають з великою швидкістю і утворенням мінімальної кількості побічних продуктів, але і чинять менший хімічний тиск на навколишнє середовище.

Так, одне із завдань, яке нам доведеться вирішити рано чи пізно, — виробництво замінника викопного палива, яке не завдавало б істотної шкоди навколишньому середовищу. Одне з можливих рішень бачиться в отриманні рідких спиртів з короткочіпочкових і газоподібних алканів, тут найперспективнішим кандидатом прийнято вважати достутанол. Його може виробляти рекомбінантна кишкова паличка Escherichia coli. Але в метаболічному шляху, який закінчиться отриманням винаймання, повинні брати участь два ферменти, яким необхідний як кофактор відновлений нікотинаденінклеотидфосфат (НАДФН), а звичайні клітини E. coli виробляють відновлений нікотинаденіндінуклеотид (НАДН), що знижує ефективність біосинтезу достутанолу. Арнольд зі співавторами використовувала спрямовану еволюцію, змінивши ферменти таким чином, що вони почали працювати з НАДН, і в результаті кишкові палички стали виробляти достутанол зі 100% -им виходом (Metabolic Engineering, 2011, v. 13 (3), pp. 345-352).

Ще одне застосування ферментів, змінених за допомогою спрямованої еволюції, — органічний синтез. Так, зв’язки «вуглець — кремній» часто зустрічаються в продуктах і напівпродуктах органічного синтезу, але абсолютно нехарактерні для природних сполук — природна еволюція так і не створила жодного ферменту, здатного каталізувати освіту такого зв’язку. Арнольд зі співавторами виявили, що білки, які містять гем, можуть каталізувати реакцію впровадження карбенів, також чужу для живих організмів.

Карбени являють собою активні похідні двовалентного вуглецю із загальною формулою RRC: (два заступники і два вільних електрони на атомі вуглецю). Карбени активно впроваджуються у багато зв’язків «елемент — водень», але роблять це вкрай нерозбірливо, утворюючи суміш продуктів приєднання. Тому біохіміки з групи Арнольд шукали білковий каталізатор, який не тільки був би здатний прискорювати впровадження карбену в зв’язок Si — Р і утворення зв’язку Si — C, але і проводити реакцію вибірково, з утворенням мінімальної кількості побічних продуктів, а в ідеалі — єдиного ізомера.

Змінені під час спрямованої еволюції ферменти каталізують освіту зв’язку Si — C

Після скринінгу продуктивності було вирішено оптимізувати ефективність білка цитохрому, що виробляється бактерією Rhodothermus marinus. Під час скринінгу виявили й інші білки, які утворювали зв’язок Si — C з більшою ефективністю, проте для цього цитохрому спостерігався 97% -ий ентіомірний надлишок (переважна освіта одного з оптичних ізомерів). Його спрямована еволюція дозволила отримати фермент, каталітична активність якого була в сорок разів вищою, ніж у вихідного білка, а енантіомірний надлишок реакції становив 99% (Science, 2016, v. 354 (6315), pp. 1048-1051).

Спрямована еволюція дозволила розробити ефективні білки-каталізатори і для отримання зв’язків «вуглець — бір» (Nature, 2017, 552, pp. 132-136), і для амінування зв’язку C — H з переважною освітою одного з оптичних ізомерів (Angew. Chem. Int. Ed. , 2014, v. 53 (26), pp. 6810–6813).

Навіть ця невелика кількість прикладів показує, що можливості спрямованої еволюції ферментів величезні. А попереду ще досить широкі перспективи — створення каталізаторів для нових хімічних процесів, збільшення їх ефективності, підвищення специфічності до різних субстрат. Біопаливо замість нафти, дешевий і нешкідливий органічний синтез. Можливо, саме білкові каталізатори дозволять людині еволюціонувати в пристойного, безпечного для сусідів мешканця Землі?

Антитіло росте на фазі

Інша половина Нобелівської премії 2018 року теж присуджена за спрямовану еволюцію білків, але вже не ферментів, а антитіл. Ключову роль в еволюції цих біомолекул зіграв метод, який отримав назву «фаговий дисплей».

Метод фагового дисплея розробив Джордж Сміт (Science, 1985, v. 228 (4705), pp. 1315-1317). Фаги, або бактеріофаги, — це віруси бактерій. Генетичний матеріал фагу укладено в капсид — упаковку з білкових молекул. Білки, природно, закодовані в геномі фагу. І якщо в ген фагового білка вставити ген іншого білка — того, що цікавить експериментатора, — при розмноженні фагу цей білок з’явиться на поверхні фагових частинок. Можна сказати, що фаг відображає на собі потрібний білок, звідси і назву методу. З таким білком зручно працювати, наприклад вивчати його взаємодії з іншими біомолекулами. Використовуючи зв’язування білка з рецепторами, легко проводити скринінг, а потім розмножувати ті фаги, які несуть білки, що відрізняються найкращим зв’язуванням. Для розмноження достатньо інфікувати фагами бактерії (зазвичай використовують ту ж кишкову паличку). А після розмноження знову повторюється раунд селекції, і таким чином створюється бібліотека білків з потрібними властивостями. Фаги тут використовуються як найпростіші конструкції, що об’єднують генотип і фенотип: легко внести зміни в ген, перевірити, як змінилися властивості білка, і знову взятися за ген.

У своїй основоположній роботі Сміт вивів на поверхню фага фрагмент рестрикційної ендонуклеази (ферменту, який розрізає ДНК у визначеному місці) з 57 амінокислотних залишків. Потім він провів одноразове аффінне очищення антисироваткою до ендонуклеази і показав, що фаг з ендонуклеазним фрагментом витягується в тисячекратному надлишку порівняно з іншими фагами. Повторення аффінного очищення дозволяє домогтися ще більшого збагачення. Сміт припустив, що за допомогою антитіл до певних білок можна буде селективно виділяти з бібліотек фаги з цими білками.

У 1988 році Джордж Сміт висловив ще одну ідею: експресія на поверхні фагів великої кількості пептидів з випадковою структурою може бути корисна для пошуку епітопів — ділянок антигену, які розпізнаються імунною системою (Gene, 1988, v. 73 (2), pp. 305-318). Це не повинно бути дуже складно, оскільки велика частина антитіл розпізнає невелику лінійну ділянку білка, що складається з п’яти або шести амінокислотних залишків.

Сміт також передбачив, що фаговий дисплей пептидів може допомогти розробці вакцин, якщо виводити на поверхню фага антигени — фрагменти білків збудника інфекції. Це передбачення стало теоретичною основою досліджень, в яких була виявлена антигенна активність пептидів збудника малярії Plasmodium falciparum.

Фаговий дисплей: принцип методу

Основи методу фагового дисплея, розроблені в лабораторії Сміта, завдяки їх простоті були негайно взяті на озброєння іншими науковими колективами. На початку 1990-х років практично одночасно з’явилися десятки робіт, що описують експресію бібліотек коротких пептидних послідовників на нітевидному бактеріофазі і підбір пептидів, що зв’язуються з певними мішенями. Метод фагового дисплея пептидних бібліотек дуже сприяв вивченню зв’язування антитіл з епітопами. А зворотний процес — фаговий дисплей антитіл і використання антигенів для селекції — став важливим кроком у розробці терапевтичних антитіл.

Нітевидний фаг fd — знаряддя фагового дисплея. Структура капсида (поперечний зріз)

У 1990 році третій нобелівський лауреат 2018 року сер Грегорі Вінтер повідомив про дисплею на нітевидному бактеріофазі повністю функціонального фрагмента антитіла (Nature, 1990, v. 348, pp. 552-554). Антитіла, вони ж імуноглобуліни, — великі молекули, що складаються з декількох білкових ланцюгів, двох легких (коротких) і двох важких (довгих). Тому Вінтер з колегами розмістив на фазі лише одноланцюжковий варіабельний фрагмент — конструкцію, в якій варіабельна частина важкого ланцюга пов’язана з легким ланцюгом за допомогою гнучкого поліпептидного лінкера. Саме варіабельні ділянки пов’язують антигени, і якраз за рахунок своєї варіабельності вони забезпечують нескінченне розмаїття антитіл, що відповідає різноманітності антигенів.

У першій роботі Вінтер і його колеги розмістили на фазі фрагменти антитіл мишей, імунізованих лізоцимом з білка курячого яйця. Виявилося, що комплекси «антитіло — фаг» пов’язуються з курячим лізоцимом, проте не з людським і не з лізоцимом з яйця індички — значить, фрагмент на фазі дуже точно повторює структуру природного антитіла. Всього дві послідовні аффінні очистки збільшили концентрацію фагу з потрібним фрагментом антитіла в мільйон разів.

Робота Вінтера, яка довела ефективність застосування фагового дисплея для підбору білкових фрагментів, що міцно пов’язуються з певним антигеном, значно спростила отримання терапевтичних антитіл, і це стало початком фармацевтичної революції. Сам Вінтер визначив кілька плідних напрямків у цій галузі. Він запропонував концепцію створення і скринінгу великих бібліотек антитіл, отриманих випадковим комбінуванням ділянок генів, які кодують варіабельні ділянки довгих і коротких ланцюгів. Ще одна його ідея — створення і скринінг повністю синтетичних антитіл.

Зрештою Вінтер показав, що можна використовувати фаговий дисплей для спрямованої еволюції антитіл і створення терапевтичних препаратів на їх основі. Він створив величезну бібліотеку фагів, що несуть мільйони антитіл. З цієї бібліотеки він вивужував антитіла, які міцно зв’язувалися з певними білками, змінював ці антитіла випадковим чином і створював другу бібліотеку, з неї відбирав антитіла з ще більшою міцністю зв’язування. У 1994 році такий підхід дозволив розробити антитіла, які специфічно розпізнають клітини деяких ліній раку.

Звідси було вже недалеко до важливих практичних застосувань. Вінтер з колегами створив компанію з розробки та виробництва фармакологічно активних антитіл. У 90-ті роки компанія вивела на ринок препарат, що являє собою видозмінене антитіло людини — адалімумаб (він також відомий під торговою маркою «Хуміра»). Це антитіло нейтралізує білок — фактор некрозу пухлини TNF-альфу, що відповідає за запальні процеси при багатьох аутоімунних захворюваннях. З 2002 року адалімумаб дозволений для лікування ревматоїдного артриту, зараз він також використовується в терапії псоріатичного артриту і анкілозуючого спондиліту.

До теперішнього часу еволюція білкових антитіл і фаговий дисплей дозволили створити антитіла від раку, які в ряді випадків успішно застосовувалися навіть для лікування метастазів, — це історичний прорив у лікуванні онкологічних захворювань. За допомогою спрямованої еволюції отримані антитіла, нейтралізуючі токсин збудника сибірки або сповільнюють розвиток вовчанки. Клінічні випробування проходять антитіла, призначені для боротьби з хворобою Альцгеймера.

Важлива перевага антитіл, отриманих за допомогою спрямованої еволюції, полягає в тому, що вони зв’язуються зі своїми мішенями в тисячі і мільйони разів міцніше, ніж антитіла, що виробляються організмом в результаті імунізації. Тому антитіла, отримані за допомогою фагового дисплея, пацієнт може самостійно вводити собі під шкіру, в той час як менш ефективні антитіла, отримані при імунізації, необхідно вводити внутрішньовенно під наглядом лікаря.

Методи, розроблені нобелівськими лауреатами 2018 року, в даний час використовують у всьому світі для створення «зелених» виробництв, отримання нових матеріалів і ліків. Френсіс Арнольд, Джордж Сміт і Грегорі Вінтер привнесли революційні методи в біологічну, синтетичну і медичну хімію, їх розробки активно застосовуються на практиці, що, будемо говорити відверто, справедливо не для всіх Нобелівських премій з хімії останніх років. Внесок у прогрес людства, згаданий Альфредом Нобелем у заповіті, є вже зараз і, очевидно, буде рости.