Не розплився як бактерія

Фото: Анатолій Жданов/Коммерсантъ

Біохімікам МДУ вдалося експериментально перевірити математичну модель того, як один з найефективніших на даний момент антибіотиків — моксифлоксацин — взаємодіє з клітинною мембраною. Модель підтвердилася. Виявилося, що антибіотик навіть занадто хороший.

Інфекційні захворювання лікуються антибіотиками — речовинами, здатними уповільнити зріст і розмноження патогенних грибків, бактерій і найпростіших. До того ж існують антибіотики, які демонструють протипухлинну активність. Всупереч поширеній думці, на віруси вони ніякого ефекту не роблять.

Антибіотики впливають на різні компоненти клітини збудника. У цьому відмінність антибіотиків від інших медикаментів: вони усувають причину захворювання, а не борються з симптомами хвороби.

Але патогени вдосконалюються, що вимагає інших ліків, тому пошук джерел нових антибіотиків — одне з найцікавіших завдань сучасних вчених. Існує й інший підхід до створення сполук, що володіють бактерицидним ефектом, — синтетичний, проте поки що він не дуже ефективний. Особливо враховуючи те, що препарат, який вбиває мікроорганізми, часто викликає у пацієнта неспецифічну реакцію, що пов’язано з впливом антибіотика на власні клітини тіла. Наприклад, нобелівський лауреат Пауль Ерліх синтезував і протестував 606 препаратів, перш ніж знайти ліки від сифілісу, які лише незначно шкодили лабораторним мишам і повністю позбавляли їх від бактерії-збудника. Звичайно, Ерліх проводив свої дослідження на початку XX століття і тому не володів технікою і обчислювальними потужностями, які доступні науці зараз. Однак і через сто років передбачувальної здатності алгоритмів все ще недостатньо для того, щоб швидко змоделювати речовину з необхідною активністю.

Де в природі шукати антибіотики

Переважна кількість сполук, що володіють антибіотичною активністю, виділена з мікроорганізмів і грибів.

Як визначити, що будь-який організм продукує антибактеріальні речовини? На початку золотого століття антибіотиків це робилося так: певний штам бактерій, грибів або цвілі поміщався на чашку Петрі, куди заздалегідь були висіяні лабораторні бактерії на тверде живильне середовище. Якщо через якийсь час зберігання цієї чашки в сприятливих для тестованого організму умовах виявлялося, що навколо нього утворилася «плеш», тобто лабораторні мікроорганізми померли, то піддослідний точно виробляє бактерицидну речовину. Потім його клітини руйнували і методично аналізували вміст, зрештою знаходячи біологічно активну речовину.

У наш час стала доступна технологія секвенування — розшифровки геному. З її допомогою можна виявити ділянку ДНК, яка кодує новий антибіотик, акуратно його вирізати і впровадити в штами-продуценти.

Нові речовини, схожі по будові з уже відомими, виявляються у вищих рослинах (клас антибактеріальних фітонцидів був відкритий в 1929 році) і глибоководних рибах, які ніколи не хворіють пухлинними захворюваннями. До того ж через вдосконалення технологій моделювання молекул відкриваються можливості отримання повністю синтетичних препаратів. Важливо, що повністю сконструйовані людиною в лабораторії препарати очистити від марних або токсичних домішок набагато важче, ніж природні: організми найчастіше мають ферментативну систему для цієї мети, тоді як синтетикам доводиться задовольнятися лабораторними методами, що не володіють ензиматичною селективністю.

Битва бактерій з антибіотиком

Використання антибіотиків пов’язане зі складнощами.

По-перше, поступово патогенні мікроорганізми можуть знайти резистентність до використовуваних проти них засобів. Наприклад, біохіміків, які довгий час працювали зі штаммами клітин, стійких до канаміцину, не можна їм лікувати від інфекцій, тому що штами могли потрапити в організм вчених і в результаті горизонтального перенесення генів прищепити зовнішньому патогену стійкість до даної молекули. Позитивна селекція з геном стійкості до певного антибіотика застосуються в молекулярній біології: при вирощуванні клітинної культури на чашці Петрі в агар — живильне тверде середовище для бактерій — додається певний бактерицидний препарат, і виживають тільки ті колонії, які можуть протистояти його дії, отримавши резистентність в результаті поділу. Той же процес протікає і в нашому організмі при несистематичному лікуванні антибіотиками.

Механізми стійкості

Передані гени можуть кодувати такі механізми стійкості:

Ефлюкс. Це активне виведення активної речовини з клітини за допомогою білкового насоса, вбудованого в мембрану клітини. У різних видах організмів рушійна сила у цього процесу різна, але схема одна: як тільки шкідлива молекула виявляється в цитоплазмі, вона переноситься до насоса, і при проходженні через нього клітина «закачує» всередину іншу речовину: іони натрію, водню.

Захисний білок. Він потрібен для інактивації антибіотика. Наприклад, пеніциліни містять у своєму складі бета-лактамне кільце, а багато бактерій виробляють фермент бета-лактамазу, який гідролізують один зі зв’язків у кільці і, як наслідок, руйнує молекулу антибіотика. А клас речовин, схожий на пеніциліни будовою, — аміноглікозиди — піддається ферментативній модифікації, щоб вони не могли зв’язуватися з рибосомами і заважати синтезу білка.

По-друге, деякі антибіотики діють на всю мікрофлору, яка є в організмі людини. Відомий модельний організм для біологічних досліджень, кишкова паличка, яка існує в кишечнику теплокровних, теж може піддаватися атаці антибіотиків поряд з патогенними бактеріями. Саме тому після курсу антибіотиків лікарі рекомендують пити відновлюючі баланс у травній системі ліків і приймати вітамін К.

По-третє, прийом антибіотиків пов’язаний з побічними ефектами: від запаморочення і зміни сприйняття смаків до лейкопенії і пошкодження суглобів. Яким би не замислювався ефект фармацевтичного препарату, його активна речовина — дуже складна органічна молекула, що складається з багатьох атомів, пов’язаних різними взаємодіями. Вона може неспецифічно зв’язуватися зі складовими еукаріотичних клітин, пошкоджуючи або деформуючи їх.

Щоб з’ясувати, як саме та чи інша компонента ліків впливає на організм людини, дослідники все частіше використовують комп’ютерне моделювання. За допомогою математичних розрахунків хімічних, електростатичних та інших взаємодій можна передбачити поведінку клітин, поблизу яких опинилася молекула антибіотика. Особливо цікаво дослідити взаємодію препаратів з клітинною оболонкою, тому що перш ніж досягти мети, молекули лікарського препарати повинні минути безліч тканин організму пацієнта, не порушивши їх цілісності. Але комп’ютерне моделювання, яким би складним воно не було, потребують експериментального підтвердження. І тут в гру вступають хіміки-ензимологи.

Покоління антибіотиків

Бактерицидні препарати розбиті на «покоління»: препарати першого покоління — ті, які були виділені з природних джерел (наприклад, пеніцилін з цвілі) і використовуються без хімічних модифікацій. Але через придбану мікроорганізмами стійкість деякі ліки перестають діяти. У такому випадку структурні фрагменти антибіотика, що інактивуються або руйнуються бактеріями, захищаються додатковим заступником — з’являються ліки другого покоління. Так, вносячи корективи у формулу діючої речовини для підвищення ефективності та швидкості її дії, а також удосконалюючи спосіб застосування, вчені створюють наступні покоління антибіотиків.

Антибіотик проти оболонки клітини

Співробітники кафедри хімічної ензимології хімічного факультету МДУ ім.М. В. Ломоносова разом з дослідниками ІНЕОС РАН під керівництвом доктора хімічних наук Олени Кудряшевої вперше експериментально перевірили математично розраховану модель взаємодії моксифлоксацину з ліпідною оболонкою клітини. Моксифлоксацин — один з найдієвіших антибіотиків широкого спектру, що вражає безліч як грамположних, так і грамотрицьких бактерій-збудників. Це протимікробний засіб класу фторхінолонів IV покоління, який з 2012 року включено до Переліку життєво необхідних і найважливіших лікарських препаратів.

Хвороботворні мікроорганізми і спектри дії антибіотиків

Структура моксифлоксацину попереджає його ефлюкс з клітки патогена (через додатковий кільця в положенні 7). Він застосовується при лікуванні гострого бронхіту, позашлюбничної пневмонії, гострого бактеріального синуситу та інших захворювань дихальних шляхів, шкірних інфекцій і уражень м’яких тканин.

Як і у всіх хінолонів і фторхінолонів, його дія спрямована на інгібування ДНК-гіраз і бактеріальної топоізомерази IV, активність яких необхідна для протікання таких фундаментальних процесів, як реплікація і транскрипція. Через інгібування цих ферментів неможливо згорнути назад розкручену суперспіраль ДНК — «розрізати» її гираза може, а ось «зшити» назад — вже ні.

Під час попередніх досліджень було з’ясовано, що більшість побічних ефектів у пацієнтів, які приймають моксифлоксацин, — чутливість до світла, тромбоз та інше — викликано неспецифічною взаємодією препарату з клітинними оболонками. Тепер потрібно було з’ясувати, що ж саме відбувається в клітці.

Клітинна мембрана людини включає в себе білки і жири, які в основному представлені фосфоліпідами. Молекула такого ліпіда складається з полярної «голови» — фосфатної групи, яка володіє гідрофільними властивостями, і неполярних хвостів — довгих вуглеводневих ланцюгів. Фосфоліпіди утворюють подвійну структуру: гідрофільні залишки в бік клітки і назовні, а між ними — прошарок з двох гідрофобних частин, званий біслоєм. У загальноприйнятій у біологів рідинно-мозаїчній моделі мембрани вважається, що білкові молекули розчинені в рідкому фосфоліпідному біслі. Отримана тонка мембранна плівка походить на мильну бульбашку — переливчаста, що існує в основному через сили поверхневого натягнення.

Щоб вивчити вплив антибіотика, в якості модельної «клітини» організму-носія дослідниками використовувалася ліпосома, сконструйована з дипальмітоілфосфатіділхоліну (DPPC), оточена стабільним частково проникним біслоєм фосфоліпіда — кардіоліпіна (CL2-).

При pH = 7,4 — фізіологічному значенні кислотності в організмі — моксифлоксацин існує у вигляді цвіттер-іону, тобто і карбоксильна група, і аміногрупа заряджені. Остання заряджена позитивно, і через це відбувається утворення комплексу моксифлоксацин — гідрофільний шар ліпідів. Цей висновок підтверджений методом ВК-спектроскопії, яка дозволила уточнити, що зв’язування протікає між азотом моксифлоксацину з ацильними і фосфатними фрагментами кардіоліпіну, тоді як гідрофільна частина DPPC захищена позитивно зарядженою холіновою групою. До того ж, при дослідженні освіти комплексу фторхінолон — ліпідна оболонка в ультрафіолетовому діапазоні з’ясовано, що спектр випромінювання антибіотика стає менш інтенсивним, що говорить про зміну його іонного стану.

Антибіотики рвуть ланцюжки спадкової інформації бактерій

«Комплексоутворення моксифлоксацину з ліпідним біслоєм впливає на температуру фазового переходу клітинної мембрани: повне опалення мембрани при додаванні антибіотика досягається при температурі на 2-3 градуси нижче, чим у контрольній системі, тобто порушується її плинність, — розповідає один із співавторів роботи, співробітник кафедри хімічної ензимології хімічного факультету МДУ кандидат хімічних наук Ірина Ле-Дейген. — Через наступні порушення рухливості білкових компонентів у рідкому фосфоліпідному бісле порушуються найважливіші функції клітинних мембран — регуляторна, транспортна та захисна. Імовірно, в крайньому випадку взаємодія моксифлоксацину з негативно зарядженою поверхнею мембрани може призвести до руйнування цілісності еукаріотичної клітини «.

Як кажуть автори роботи, дане дослідження не просто дозволяє краще зрозуміти, як антибіотики, що повсюдно застосовуються для лікування теплокровних, можуть негативно впливати на їх організм. Йдеться про зміну напрямків розробки нових антибіотиків на основі отриманих даних. Швидше за все, зміни у формулах майбутніх препаратів будуть спрямовані не стільки на підвищення їх ефективності, скільки на зменшення кількості побічних ефектів. Менша кількість супутніх впливів може бути досягнута і за допомогою адресної доставки, яка на даний момент не застосовується до хінолонів і фторхінолонів.

Механізми впливу антибіотиків

Більшість наявних препаратів сприяють руйнуванню клітинної мембрани мікроорганізму. Так, наприклад, діють пеніциліни. Вони зв’язуються з ферментом-каталізатором однієї зі стадій утворення пептидних зшивок у муреїні (основному компоненті клітинної оболонки грамположних бактерій), тому що за своєю структурою нагадують його субстрат. Іншою своєю частиною — бета-лактамним кільцем — молекула антибіотика наближається до залишку серіна у складі ферменту і утворює міцний з ним зв’язок, який блокує активний центр. Цей процес сприяє синтезу ослабленої клітинної стінки і веде до загибелі клітини мікроорганізму. Найчастіше такі антибіотики застосовуються разом з інгібіторами бактеріальних ферментів бета-лактамаз, які можуть порушити структуру речовини. Подібним механізмом впливу володіють і цефалоспорини.

Інший тип перешкоджає нормальному виробленню білків, інгібуючи трансляцію, впливаючи на рибосому, мРНК тощо. Деякі класи антибіотиків — аміноглікозиди і тетрацикліни — заважають нормальному функціонуванню малої суб’єдиниці рибосоми, тобто синтезу білка. Одні провокують появу помилок при збиранні білка з матричною РНК — в білкову послідовність вбудовуються не ті амінокислоти. Інші заважають пов’язуванню малої суб’єдиниці рибосоми з амінокислотою, яка повинна продовжити синтезований ланцюг пептида.

Ще один клас антибіотиків заважає синтезу ДНК у процесі реплікації, блокуючи дії ферментів — гіраз і топоізомераз. Ці ензими необхідні для «розгортання» подвійної спіралі ДНК у клітці: для цього потрібно зробити надріз, а потім зашити один з ланцюгів. Але антибіотики на кшталт хінолонів і фторхінолонів інгібують зшивку, через що в ДНК залишається одноланцюжковий розріз. Перевага використання таких препаратів у тому, що вони фармацевтично впливають виключно на бактеріальний фермент топоізомеразу IV. Також вони надають ефект на ДНК-гиразу або топоізомеразу II, яка присутня в еукаріотичних клітинах. Тому цей клас антибіотиків застосовується як цитостатичні препарати.

Існують і інтеркалюючі агенти — препарати, що вбудовуються між парами підстав у подвійній спіралі ДНК і перешкоджають і реплікації, і транскрипції, наприклад, антрацикліновий клас. Але хімічно ДНК в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах однакова, тому подібні антибіотики дуже токсичні для організму-носія. Вони застосовуються лише для лікування злоякісних пухлин.

Ще один цікавий тип антибіотиків — транспортний. Вони інтегруються в плазматичну мембрану бактерії і, працюючи як іонні канали, виводять іони з її клітини, внаслідок чого вона гине.