«Нервові клітини обмінюються РНК, упакованою в схожу на капсид ВІЛ оболонку»

Ріс. 1. Загальна схема передачі мРНК гена Arc між нейронами. У клітці — «донорі» ділиться і транслюється мРНК гена Arc. Молекули однойменного білка спонтанно збираються в структури, які по будові близькі до капсидів ретровірусів. Ці структури укладають в себе кодуючу їх мРНК. Потім вони покриваються плазматичною мембраною і в складі мембранних бульбашок відокремлюються від клітини. Зливаючись з нейроном- «реципієнтом», такі бульбашки вивільняють і «капсиди», і мРНК гена Arc. Як правило, процес відбувається в районі контактів між нервовими клітинами. Малюнок з обговорюваної статті в Cell

Активність гена Arc в нервових клітинах ссавців критично важлива для запам’ятовування нової інформації. Порушення експресії цього гена спостерігаються при ряді неврологічних захворювань, зокрема, хвороби Альцгеймера. Однак досі про функції продукту гена Arc, тобто білка з однойменною назвою, було відомо вкрай мало. Нове дослідження показало, що молекули білка Arc мимовільно збираються в структури, що нагадують вірусні капсиди і містять мРНК гена Arc. Вони полягають у мембранних бульбашках, які нервові клітини виділяють назовні. Ці бульбашки зливаються з іншими нейронами. Там мРНК Arc вивільняється і транслюється. Такий спосіб обміну інформацією між нервовими клітинами показаний вперше.

В основі здатності тварин запам’ятовувати інформацію лежить синаптична пластичність — зміна інтенсивності передачі сигналів між нервовими клітинами, або нейронами. Воно може бути короткочасним (кілька хвилин або годин) і довготривалим (доба і більше). Головна відмінність форм довготривалої пластичності від короткочасної — синтез білків. У першому випадку він відбувається, а в другому, як правило, ні. Деякі гени починають експортуватися (тобто з них синтезуються копії мРНК, а вони, в свою чергу, використовуються для побудови молекул білків) практично відразу ж після активації конкретного синапсу — контакту між нейронами. Білки, що утворилися, змінюють будову свого синапсу, роблячи її більш-менш значущою в ланцюгу передачі сигналів.

У число генів, що швидко активуються, входить Arc. Він цікавий тим, що за структурою дуже нагадує гени вірусних Gag-білків (скорочення від group-specific antigen). Ці гени характерні для ретровірусів, таких як ВІЛ. Очевидно, гени Gag-білків сталися від ретротранспозонів Ty3/gypsy. Ретротранспозони — це ділянки ДНК, здатні переміщатися по геному. Притому вони роблять це не самі, а через проміжні молекули. Спочатку з них зчитується мРНК, а потім під час зворотної транскрипції за її «шаблоном» утворюються фрагменти ДНК, ідентичні початковим ретротранспозонам. Той же процес відбувається і при розмноженні ретровірусів в клітинах господаря. Отримані ділянки ДНК вбудовуються в нові області геному (рис. 2). Цікаво, що у ссавців до половини всієї ДНК становлять саме ретротранспозони, а у рослин їх частка в геномі може бути ще вище.

Ріс. 2. Переміщення ретротранспозонів по ДНК. Пояснення в тексті. Малюнок з сайту en.wikipedia.org

Функції білка, кодованого геном Arc, в загальних рисах відомі на органному і молекулярному рівнях. Він активно синтезується в місцях контакту нейронів при тривалій зміні їх активності і бере участь у процесах довготривалої синаптичної пластичності. Arc керує деякими процесами синтезу білка в таких контактах і регулює число рецепторів до нейромедіатора глутамату в мембранах нервових клітин (про це трохи докладніше буде сказано пізніше). Брак молекул Arc або їх активності спостерігається при хворобі Альцгеймера (J. Wu et al., 2011. Arc/Arg3.1 Regulates an Endosomal Pathway Essential for Activity-Dependent ^-Amyloid Generation), а також шизофренії та синдромі ломкою Х-хромосоми (S. Park et al., 2008. Elongation Factor 2 and Fragile X Mental Retardation Protein Control the Dynamic Translation of Arc/Arg3.1 Essential for mGluR-LTD). Однак багато деталей дії Arc, а також походження кодуючого цей білок гена були неясні.

Автори обговорюваної роботи прояснили еволюційні корені Arc. Для цього вони порівняли послідовності ДНК цього гена у різних організмів, починаючи з щурів і птахів і закінчуючи комарами і плодовими мушками (рис. 3). У деяких тварин, наприклад, у костистих риб, прямих гомологів щурячого Arc не знайшлося, проте найближче до нього по будові у цих організмів були ретротранспозони Ty3/gypsy. Цікаво, що серед комах гомологи Arc, dArc1 і dArc2, виявилися тільки у невеликої групи мух. У інших двохкрилих, таких як комарі, їх не знайшли. Це говорить про те, що мухи і наземні хребетні (у всіх них Arc присутня) отримали dArc і Arc незалежно один від одного, але з одного джерела — ретротранспозонів Ty3/gypsy, що служать предками і генам Gag-білків.

Ріс. 3. Філогенетичне древо гена Arc і найближчих до нього по будові генетичних елементів у тварин і дріжджів. Зелені прямокутники — Arc, по будові дуже близький до генів Gag. Прямокутники інших кольорів — найближчі до Arc по будові фрагменти генома. Зображення з обговорюваної статті в Cell

Краще зрозуміти походження Arc було важливо, оскільки це дало б інформацію про його можливі властивості. Оскільки цей ген виявився близьким до ретротранспозонів Ty3/gypsy, дослідники звернулися до даних про їхню «поведінку». Відомо, що їх білкові продукти можуть мимовільно збиратися в невеликі частинки, які по будові схожі на оболонки вірусів — капсиди. Потрібно було зрозуміти, чи будуть робити те ж саме білки, кодовані щурячим Arc і мушиним dArc1.

Щоб відповісти на це питання, дослідники впровадили відповідні гени в бактерії, а потім виділили і очистили синтезовані цими бактеріями білки. З них, у свою чергу, ізолювали Arc і dArc1. Частинки, які утворили молекули цих білків, вивчили за допомогою кріоелектронної мікроскопії. Вона показала, що молекули теж спонтанно утворюють структури, схожі на білкові вірусні оболонки. Середній діаметр таких «капсидів» склав 32 нанометри.

Однак цей експеримент не давав відповіді на питання про те, як буде вести себе Arc в реальній клітці. Щоб дізнатися це, білок ввели в культуру клітин HEK 293. Ця клітинна лінія отримана з нирок ембріона людини (human embryonic kidney, звідси їх назва), і в цих клітинах Arc не утворюється. Потім на них подіяли спеціальними агентами для крос-лінкінгу (див.: Cross-link). Як контроль у деякі культури HEK 293 вводили зелений флуоресцентний білок (GFP), який ніяких схожих на капсиди утворень не формує і спочатку в людських клітинах не присутній. Крос-лінкінг — це процес, в ході якого одна молекула полімеру під дією особливих реагентів зшивається з молекулою іншого полімеру. На мономери такі реагенти не діють. В описуваному випадку в ролі полімерів виступали «капсиди» з декількох молекул Arc, а в ролі мономерів — окремі молекули білків Arc і GFP. Якби молекули GFP теж з’єднувалися один з одним, то утворені структури грали б роль «полімерів» для реагентів крос-лінкінгу.

Після обробки реагентами для крос-лінкінгу обох груп клітин (HEK 293 з Arc і HEK 293 з GFP) з клітин першої групи очистили і виділили Arc, з клітин другої — GFP. Далі виділене піддали електрофорезу в поліакриламідному гелі: зовнішнє електричне поле змушує молекули рухатися від одного краю платівки, вкритої поліакриламідним гелем, до іншого. Молекули білків переміщуються всередині поліакриламідного гелю, що має пори певного діаметру. Чим більші молекули білків, тим повільніше вони проходять через ці пори і, відповідно, за заданий відрізок часу долають меншу відстань, ніж дрібніші молекули. Відомо, яка відстань за певний час проходять одиночні молекули Arc і одиночні молекули GFP. Результати електрофорезу виділених з тих клітин білків показали, що GFP йде зі своєю звичайною швидкістю, а Arc — в кілька разів повільніше, ніж повинен, тобто він був важче «належного». Звідси було зроблено висновок, що молекули білка Arc утворювали в клітинах HEK 293 під дією агентів для крос-лінкінгу олігомери — досить міцні скупчення з декількох молекул, точніше, з декількох «капсидів». А молекули GFP такі структури не утворювали. Таким чином було доведено, що Arc збирається в «капсиди» і в живих клітинах ссавців, а не тільки in vitro.

Будь-яка вірусна частинка містить нуклеїнову кислоту, в іншому випадку вона не функціонуватиме навіть у клітці-господарі. Відповідно, для повної схожості з ретровірусами «капсиди» з Arc повинні полягати в себе молекули спадковості. Побічно це підтверджувалося даними спектрофотометрії очищеного Arc: згідно з ними, всі зразки очищеного білка все одно містили значну кількість РНК. Якщо це так, то РНКази не повинні руйнувати мРНК у складі «капсидів» Arc. Так і вийшло: середовища, що містили тільки мРНК (притому будь-якого виду), змінювали свій склад під дією РНКаз, а з розчинами, де містилися і Arc, і мРНК, нічого не відбувалося. Це тому, що останні були упаковані в «капсиди» з перших.

За відсутності мРНК «капсиди» з молекул Arc не збиралися. Це ще одна схожість даного білка з ретровірусними Gag. А експерименти на бактеріях з різними видами мРНК показали, що для утворення впорядкованих структур Arc не важливо, яку мРНК в себе укладати. Більше того, не обов’язково, щоб це була рібонуклеїнова кислота. Обов’язкових умов тільки дві: молекула нуклеїнової кислоти повинна бути одноланцюжковою і мати довжину принаймні 20 нуклеотидів. Тобто Arc- «капсиди» можуть нести в собі майже будь-яку мРНК. Чому тоді в них виявили саме мРНК гена Arc? Мабуть, справа в її кількості. Вона інтенсивно накопичується в місцях контактів між нейронами під час і відразу після активної передачі по них. Можна сказати, що завдяки великій кількості її молекул ймовірність потрапляння мРНК Arc в «капсиди» вища, ніж у інших нуклеїнових кислот.

Нічого з описаного вище не мало безпосереднього відношення до нервової системи і не давало відповіді на питання, чи виділяються частинки з Arc назовні клітин. Щоб це з’ясувати, дослідники вдалися до експериментів на культурах клітин. По-перше, вони використовували вже згадані HEK 293, які «змусили» експресувати Arc. Якщо ці клітини виділяли б відповідний білок, він би виявлявся поза ним, в тому середовищі, на якому вони росли. Тож це середовище відфільтрували і виявили в ньому мембранні бульбашки діаметром близько ста нанометрів, а в них — уже знайомі нам «капсиди» з Arc.

Схожу процедуру провели і з культурами клітин кори головного мозку мишей. У цьому випадку на мембранні бульбашки ще подіяли травним ферментом — трипсином. Ні Arc, ні мРНК при цьому не постраждали. Оскільки трипсин не здатний руйнувати ліпіди, з яких складаються мембрани обговорюваних бульбашок, дослідники зробили висновок, що білок і мРНК дійсно включені в ці бульбашки. Так було показано, що нейрони утворюють «капсиди» з Arc з мРНК всередині і виділяють їх назовні покритими ліпідною мембраною. До речі, це знову нагадує нам про ретровірусів: дуже часто вони поверх капсида мають суперкапсид, основу якого складає мембрана з ліпідів.

Залишилося зрозуміти, що відбувається з описаними бульбашками після їх виділення з клітин. Дослідники припустили, що, подібно до ретровірусів, ці бульбашки виділяють РНК в клітку, з якою зливаються. Цю тезу перевірили і на культурах нервових клітин, і на HEK2 93. У разі HEK взяли три групи культур. У клітини першої групи були вставлені гени Arc і GFP, у клітини другої — тільки GFP, ну а клітини третьої групи були «наївні» — їх ДНК не модифікували. Після 18 годин інкубації середу від перших двох груп колоній переносили в чашки Петрі з колоніями третьої групи, а потім чекали ще добу, щоб ефект проявився. Світитися зеленим починали тільки ті клітини, яким дісталося середовище від HEK 293, що містили і ген Arc, і ген GFP (вони передавалися разом завдяки особливостям використаної модифікації ДНК). Подібні результати отримали і в разі культур нейронів.

Нарешті, необхідно було з’ясувати, чи грає перенесена за допомогою Arc мРНК в нейронах- «реципієнтах» будь-яку роль, чи транслюється вона там, і від чого залежить її трансляція. Оскільки було відомо, що Arc відіграє певну роль у синаптичній пластичності, логічно було б припустити, що стан «донорської» мРНК регулюється активністю «реципієнта», яка містить її клітини. Для перевірки цієї тези взяли нейрони з «вимкненим» геном Arc і в середу, в якій вони перебували, додали мембранні бульбашки, що містять вже знайомі нам Arc- «капсиди» з мРНК однойменного гена всередині. Через деякий час у ряді культур нейрони активували впливом на одну з груп їх мембранних рецепторів, а в інших — навпаки, придушували здатність нервових клітин подавати сигнали.

Через чотири години — цього часу достатньо, щоб почалося утворення білка на матриці нових мРНК — у всіх культурах заміряли вміст білків. У тих, чиї нейрони були більш активні, він виявлявся вище, а в тих, де передача сигналів була придушена, вміст білків не зростав. Так було встановлено, що мембранні бульбашки, що несуть в собі капсідоподібні структури з білка Arc, що містять мРНК, виділяються нейронами назовні і зливаються з іншими нервовими клітинами — «реципієнтами». Інтенсивність трансляції мРНК в останніх залежить від того, наскільки активно вони обмінюються сигналами з іншими нейронами.

Поки роль заново відкритих бульбашок з мРНК і «капсидами» в синаптичній пластичності не встановлена, але практично немає сумнівів у тому, що вона існує. З попередніх досліджень відомо, що білок Arc задіяний у знищенні зайвих шипиків в маловикористовуваних контактах між нейронами і в зменшенні числа AMPA-рецепторів до глутамату на мембранах нервових клітин шляхом занурення цих рецепторів в цитоплазму (J. D. Shepherd et al., 2006. Arc/Arg3.1 Mediates Homeostatic Synaptic Scaling of AMPA Receptors). Обидва ці процеси спрямовані на зміну синаптичних терезів, тобто значущості окремо взятих контактів між нейронами залежно від активності передачі сигналів по них. У зв’язку з цим автори обговорюваної роботи припускають, що мембранні бульбашки з білком Arc і кодуючою його мРНК потрібні для зміни інтенсивності передачі сигналів у нейронах поблизу від клітини, що виділяє ці бульбашки. Ця зміна повинна допомагати нейронам консолідувати інформацію — тобто запам’ятовувати її, відсікаючи зайве.

Цікаво, що окремо обидва феномени — роль ретротранспозонів у синаптичній пластичності і передача мРНК від клітини до клітки — вже були показані. Правда, друге явище досі вивчали в основному на прикладі ракових клітин. Так, у 2005 році колектив польських і американських біологів продемонстрував, що в мембранних бульбашках, які клітини злоякісних пухлин транспортують до моноцитів містяться не тільки білки (це було встановлено раніше), але і мРНК (M. Baj-Krzyworzeka et al., 2005. Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes).

За результатами того дослідження неможливо було сказати, чи здійснюють ці мРНК якісь функції в клітці, в яку потрапляють. На це питання та ж група вчених відповіла у своїй наступній роботі, опублікованій роком пізніше (J. Ratajczak et al., 2006. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery). Ембріональні стовбурові клітини, використані в цьому дослідженні, виділяли мембранні бульбашки з мРНК і білками всередині. Зливаючись з гемопоетичними клітинами-попередниками (ДП), такі бульбашки підвищували виживаність цих клітин і прискорювали їх проліферацію. Експерименти проводили in vitro в системі, що містить тільки мембранні бульбашки і гемопоетичні клітини-попередники. Коли ці бульбашки обробляли РНКазами або деякий час тримали при високій температурі, ДП виживали і ділилися нітрохи не краще, ніж у контролі, тобто без додавання мембранних бульбашок. РНКази розщеплювали мРНК, а нагрівання призводило до виходу з ладу білків. Так було встановлено, що за позитивну дію мембранних бульбашок від ембріональних стовбурових клітин на ДП відповідають саме мРНК і білки, що містяться в них.

На багато питань про мембранні бульбашки, що містять «капсиди» з Arc, ще тільки належить відповісти. Зокрема, незрозуміло, як вони стикуються з мембранами клітин- «реципієнтів» і чи містять вони ще що-небудь крім молекул білка Arc і мРНК. Також поки невідомі закономірності виділення таких бульбашок — які конкретно події його запускають і в яких ділянках мозку воно найчастіше відбувається. Все це — предмет майбутніх досліджень.

Джерело: Elissa D. Pastuzyn, Cameron E. Day, Rachel B. Kearns, Madeleine Kyrke-Smith, Andrew V. Taibi, John McCormick, Nathan Yoder, David M. Belnap, Simon Erlendsson, Dustin R. Morado, John A. G. Briggs, Cédric Feschotte, and Jason D. Shepherd. The Neuronal Gene Arc Encodes a Repurposed Retrotransposon Gag Protein that Mediates Intercellular RNA Transfer // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2017.12.024.

Див. також:

1) РНК у позаклітинних везикулах зовсім не схожа на клітинне сміття, «Елементи», 07.11.2017.

2) Клітини організму спілкуються за допомогою послань, упакованих у мікровезікули, «Елементи», 28.12.2010.

Світлана Ястребова