Німецькі біотехнологи створили з ДНК штучні іонні канали

Молекула альфа-гемолізину — стрептококового токсину — надихнула біотехнологів на виготовлення штучного іонного каналу. Зображення з сайту 3dmoleculardesigns.com

Іонні канали — це один з головних інструментів, за допомогою яких клітина обмінюється речовиною із зовнішнім світом. Ці складні молекулярні пристрої, подібно до вахтерів на КПП, одночасно аналізують молекули, і контролюють потік частинок через клітинну мембрану. Німецькі вчені, творці штучної версії такого каналу, вважають, що їхній аналог може виконувати обидві функції. Пропускну здатність визначають параметри іонних каналів (форма, діаметр, що заряд проходить крізь канал молекули), і ці параметри можна змінювати за бажанням дослідників. Аналітичні можливості штучних каналів, як було підтверджено серією експериментів, теж можна порівняти з природними: вони надійно розрізняють полімерні молекули за довжиною і конфігурації.

Як відомо, у двошарову ліпідну мембрану клітини вбудовані білкові комплекси, які крім іншого контролюють потік різних молекул всередину клітини і назовні. Пропуском можуть служити і специфічні молекули, розпізнавані поверхневими рецепторами, і розмір, і конфігурація, і заряд молекул. Частина таких мембранних комплексів іменується іонними каналами, через них заряджені частинки відправляються назовні або всередину клітини. Всі процеси, які залежать від різності потенціалу на мембрані, — а таких дуже багато — засновані на роботі іонних каналів. Будь-яка жива істота залежить від своїх іонних каналів: без них неможливі проходження нервових імпульсів (одного цього достатньо!), м’язові скорочення, водний обмін і багато іншого. Дослідженню принципів їх дії та їх класифікації за функціями та будовою присвячена помітна галузь науки фізіології.

І ось тепер біотехнологи дійшли до того, що спроектували і зробили працюючий штучний іонний канал. Їх приваблювала ідея змоделювати канал з передбачуваними властивостями. Творцями версії штучних іонних каналів стали німецькі вчені з Мюнхенського технічного університету та Мічиганського університету в Анн Арборі (США). Вони вирішили уподібнити своє творіння природному каналу альфа-гемолізину — білку-токсину, що виділяється стрептококами і стафілококами. Це один з найбільш вивчених канальних комплексів, його будову розшифрували першим, і влаштований він простіше за інших.

Механізм роботи альфа-гемолізина такий. Як відомо, концентрації різних іонів всередині і зовні клітини сильно відрізняються. Наприклад, іонів калію багато всередині клітини і мало зовні, а іонів натрію — навпаки, багато зовні і мало всередині. Через це виникає різність потенціалів між внутрішньою і зовнішньою поверхнями клітинної мембрани — мембранний потенціал (докладніше про нього розказано в замітці Виявлено ще один спосіб, за допомогою якого нейрони контролюють свою збудливість, «Елементи», 15.07.2010). На цей потенціал, як вже говорилося вище, «зав’язана» величезна кількість процесів, що відбуваються в клітці — наприклад, з його допомогою здійснюється транспорт через мембрану певних речовин (див. симпорт). Тому наявність мембранного потенціалу абсолютно необхідна для життя клітини.

І ось деякі патогенні бактерії (наприклад, стрептококи і стафілококи) навчилися користуватися тим, що при порушенні мембранного потенціалу клітина гине. Опинившись біля клітини, ці бактерії починають виділяти білки, які збираються в іонний канал — гемолізин — на клітинній мембрані. Цей канал, на відміну від «доброчесних» каналів нормальної мембрани, пропускає не строго певні іони в строго певний момент, а всі іони поспіль і постійно (тобто, по суті справи, це не канал, а просто «дірка», пора). В результаті концентрації іонів по обидва боки мембрани вирівнюються, мембранний потенціал зникає і клітина гине. Найбільш вразливі для таких атак червоні клітини крові, еритроцити, і, власне, тому гемолізин (у перекладі з грецької «розчинний кров») і отримав свою назву.

Звичайно, вченим канал потрібен не для вбивства клітин. Такий канал, подібно демону Максвелла, дозволив би відсортувати на одному боці мембрани тільки строго певні молекули. А вже використовувати подібну властивість можна по-всякому.

Альфа-гемолізин складається з семи (шести-восьми) білкових суб’єднань, які формують порожній бочонок. Цей бочонок прикріплюється до мембрани гідрофобним донцем. До дінця приєднана трубка з залишків лізину і глутамату, вона-то і проходить крізь мембрану. Діаметр внутрішнього отвору трубки 2,2 нм, у найвужчій частині прикріплення до дінця — близько 1,5 нм. Приблизно таку ж за формою структуру, але тільки в основі своїй з ДНК, змоделювали німецькі біотехнологи.

ДНК виявилася дуже зручною молекулою. Вказавши первинну структуру молекули (тобто послідовність нуклеотидів), можна передбачити і вторинну і третинну її структуру. Іншими словами, отримати молекулу вказаної форми та розміру.

На відміну від білків, для яких відомо двадцять мономерів — амінокислот, — між якими існують складні відносини (кожна можлива пара амінокислот може сильно або слабо притягуватися або відштовхуватися залежно від заряду, розчинності у воді і жирах тощо), ДНК утворена всього чотирма нуклеотидами, відносини між якими прості: аденін з’єднується з тіміном, а гуанін — з цитозином. Тому створити з декількох одноланцюжкових відрізків ДНК просторовий комплекс з заданими властивостями легко — це все одно що робити моделі з сірників. Там, де «сірники» (тобто відрізки ДНК) повинні бути з’єднані, треба поставити «скріпки» — короткі олігонуклеотидні відрізки, комплементарні потрібним ділянкам «сірників». При цьому ДНК «сірники» куди цікавіші в просторовому відношенні, ніж звичайні дерев’яні сірники: якщо їх скріпити певних чином, вони можуть зігнутися і повідомити підсумковій тривимірній структурі ще більш складну форму. Звичайно, все не так просто, і треба завжди прораховувати структуру комплексу так, щоб один з одним не з’єдналося що-небудь зайве. Однак при правильному використанні дана методика (відома також як «ДНК-орігамі»; див. DNA origami) дозволяє створювати досить складні тривимірні комплекси з заданими властивостями.

І в даній роботі це з успіхом було виконано. Дослідники створили штучний ДНК-­ амний канал (рис. 1), основні характеристики якого збігалися з такими для альфа-гемолізину: діаметр пори становив 2 нм, довжина близько 47 нм, сила іонного потоку 0,87 наносіменса (про іонні струми через канали розказано в главі «Рівняння Нернста і потік іонів» у книзі «Молекулярна біологія клітини»). Канал спочатку сам себе будував на мембрані, а потім, зміцнившись, починав проводити іонний струм через мембрану. Струм через одиничний канал, як і передбачалося, був більш-менш постійним.

Ріс. 1. Ось такий вийшов іонний канал. А — вид спереду і збоку. B — поперечний зріз каналу на мембрані. Червоним кольором показано власне трансмембранний канал; білі стрижні — 54 домени двцепочкової ДНК, упаковані у формі сот; до кінців цих доменів прикріплені одноланцюжкові нитки, спарені з холестерол-модифікованими олігонуклеотидами (помаранчеві нитки і стрижні). Ці останні допомагають бочонку з ДНК закріпитися на ліпідній мембрані. C — усереднений вид каналу зверху і збоку в електронному трансмісійному мікроскопі. Зображення з обговорюваної статті в Science

Так само, як і клітинні іонні канали, штучні аналоги могли пропускати одноланцюжкові ДНК з одного боку мембрани на інший. При проході молекули ДНК через канал отвір закривається і струм блокується. Тому про проходження молекул через пори судять за характерною картиною стрибків сили струму: момент проходження великої молекули через канал на розгортці струму виглядає як локальний мінімум. Чим більше на молекулі заплутаних петель і прикріплених залишків, тим довше час блокування струму і тим менше часу канал відкритий. Для кожного з досліджених видів молекул вчені зафіксували свою специфічну картину проходження через канал (рис. 2). Це означає, що за допомогою штучних іонних каналів можна аналізувати молекули в розчині.

Ріс. 2. A — так змінюється струм через канал, коли через нього в одну або іншу сторону проходить одноланцюжкова ДНК з петлею на кінці; видно, що розрізняються і час, і амплітуда блокад. B — тут зображені зміни струмів при проходженні згорнутого нуклеотидного комплексу через канал: з коротким тимідиновим хвостом у 60 нуклеотидів (вгорі) і довгим, у 125 нуклеотидів (внизу). Видно, що чим довший хвіст, тим більше час блокади струму. Зображення з обговорюваної статті в Science

А якщо в структуру будівельної ДНК внести невеликі зміни? Звичайно, зміни повинні бути такі, які задумав дослідник, який побажав отримати інші пропускні здібності каналу. Дійсно, моделюючи петлі в структурі будівельних блоків ДНК, вчені отримали канали з заданими характеристиками (рис. 3).

Ріс. 3. Розподіл часу, коли канал відкрито. Червоним кольором показано базовий варіант каналу, сірим кольором — варіант з внесеною зміною. Пропускний час каналу залежить від природних флуктуацій в будівельних молекулах, від діаметра пор і від заряду різних його частин; видно, що для двох сконструйованих каналів ця характеристика розрізняється. Зображення з обговорюваної статті в Science

Зрозуміло, що конструювання штучних іонних каналів — це область майбутніх технологій. Передбачається, що подібні наноустрою стануть не тільки перспективними молекулярними аналізаторами, а й лікарськими агентами з найширшою областю застосувань. Залишається сподіватися, що це майбутнє не дуже віддалене, тут наука розвивається прямо-таки c космічною швидкістю. Ось, наприклад, кумедна ремарка зі статті: «У минулому було показано, що нанорозмірні мембранні пори потенційно можуть виявитися виключно корисними мономолекулярними біосенсорами» (і далі кілька посилань на літературу). Якщо судити за цими посиланнями, то «минулими» автори роботи вважають 2001-2010 рр. Минуле стрімко забирається, але так само стрімко наближається майбутнє.

Джерела:

1) Martin Langecker, Vera Arnaut, Thomas G. Martin, Jonathan List, Stephan Renner, Michael Mayer, Hendrik Dietz, Friedrich C. Simmel. Synthetic Lipid Membrane Channels Formed by Designed DNA Nanostructures // Science. 2012. V. 338. P. 932–936.

2) Michael S. Strano. Functional DNA Origami Devices // Science. 2012. V. 338. P. 890–891. (Популярний синопсис статті.)

Олена Наймарк