Новий метод MicroED визначає молекулярну структуру речовини за півгодини

Ріс. 1. Визначення структури молекули прогестерону за допомогою нового методу електронної дифракції. Порошок з банки з прогестероном висипають на серветку, злегка подрібнюють, наносять крупинки на спеціальну сітку для приміщення в електронний мікроскоп, в мікроскопі зразок заморожується до температури рідкого азоту, крупицю (нанокристал) опромінюють пучком електронів, протягом трьох хвилин збирають дані дифракції електронів на спеціальну КМОП-матрицю, аналізують їх комп’ютерною програмою, і через десять хвилин програма видає малюнок структури з роздільною здатністю менше одного ангстрема (1º). Синьою сіткою навколо атомів позначена амплітуда їх вібрації. Весь процес від відкриття банки до отримання структури займає менше півгодини. Малюнок з обговорюваної статті

Достовірне визначення молекулярної структури речовини (особливо нових речовин) — це майже завжди тривалий процес, що включає в себе очищення, приготування зразків і використання декількох незалежних аналітичних і фізичних методів аналізу. Він може займати дні, тижні або місяці. Але схоже, ми знаходимося на порозі революції в цій області: дослідники зі США виклали у відкритий доступ препринт статті з описом нового прямого методу визначення структури органічних молекул у твердому вигляді за допомогою електронної дифракції, який видає результат буквально за півгодини. Такий прорив став можливий завдяки опроміненню зразка пучком електронів з різних сторін і спеціально розробленому алгоритму аналізу отримуваної дифракційної картини.

З самого початку історії хімії визначення структури речовин було одним з найважливіших і при цьому найскладніших завдань. Практично всі хімічні дослідження або рутинні перевірки включають в себе визначення структури речовини. У художніх фільмах, аж ніяк не тільки фантастичних, дуже часто можна бачити, як хімік кладе тільки що знайдений зразок у прилад — і у нього на екрані відразу з’являється структура досі невідомої молекули. У справжніх хіміків такі кадри можуть викликати лише ухмилку. Деякі методи миттєвого визначення структури є і використовуються, наприклад, в аеропортах для пошуку наркотиків і вибухових речовин. Але всі ці методи націлені на дуже обмежену кількість молекул, всі без винятку є непрямими і структуру чого-небудь нового, не закладеного в них, розпізнати не здатні.

Створено і безліч лабораторних методів, які застосовуються, коли швидкість не дуже важлива, зате потрібно якомога точніше виявити структуру молекули. Це визначення точок кипіння і плавлення, вимірювання спектрів поглинання і відображення хвиль різних довжин (див. Ультрафіолетова спектроскопія та Інфрачервона спектроскопія), елементний і спектральний аналізи (визначення продуктів горіння та їх спектрів) і багато інших. У наші дні найбільш популярними є ЯМР-спектроскопія, мас-спектрометрія та рентгенокристалографія. Перші два методи — непрямі: з їх допомогою структура визначається не безпосередньо, а через сигнали взаємодії магнітних ядер з магнітним полем (у разі ЯМР-спектроскопії) і через визначення молярних мас іонізованих продуктів розпаду (у разі мас-спектрометрії). Через непрямість визначити структуру не завжди виходить, і можливі помилки. На даний момент немає комп’ютерної програми, яка, проаналізувавши отримані цими методами спектри, зможе визначити структуру нової речовини. Тому золотим стандартом вважається третій метод — рентгенокристалографія.

Цей метод заснований на вимірюванні дифракції рентгенівських променів, відображених від кристала речовини: з отриманої дифракційної картини вираховується молекулярна структура з роздільною здатністю до окремих атомів, якщо вони більше водню (атоми водню видно не завжди, і їх розташування часто екстраполюють). Структури, визначені цим методом з досить хорошою роздільною здатністю, сумніву майже ніколи не піддаються, і все б добре, але далеко не будь-яку речовину можна кристалізувати. І навіть коли кристалізувати виходить, кристал повинен бути високої якості (з невеликою кількістю дефектів) і видимого розміру (бажано — міліметрового). На отримання таких кристалів можуть йти тижні, процес складно відтворюємо і багато в чому залежить від випадку. Проте багато журналів і рецензентів відмовляються приймати публікації про нові речовини без рентгеноструктури. Та й самі хіміки без цього аналізу часто не можуть бути впевнені у своєму відкритті і навіть у правильності аналізу відомих речовин.

Тому нескладно уявити збудження, що охопило хіміків у всьому світі, коли тиждень тому у відкритий доступ на сайті препринтів хімічних статей chemrxiv.org була викладена стаття з описом прямого методу визначення структури молекул, який вимагає всього декількох десятків хвилин, підходить майже для будь-яких твердих речовин і для якого вистачає нанорозмірного зразка (рис. 1). Речовина все одно має бути в кристалічній формі, але розмір може бути настільки крихітним, що отримати кристали достатньої якості (без дефектів) не представляє труднощі. Настільки дрібні кристали часто утворюються спонтанно при висушуванні розчину — проблему для застосування в рентгенокристалографії представляє їх багаторазове укрупнення без утворення дефектів. Метод, названий авторами MicroED (абревіатура від micro-electron diffraction — «мікроскопія + електронна дифракція»), є адаптацією і поліпшенням технології електронної кристалографії в кріоелектронній мікроскопії, яка використовувалася досі для визначення структури білків, і за яку була вручена Нобелівська премія з хімії в 2017 році.

Оскільки взаємодія електронів з речовиною набагато сильніша, ніж у рентгенівських фотонів, для отримання високої роздільної здатності потрібна значно менша кількість сканувань і, відповідно, кристал набагато меншого розміру. Однак, для невеликих молекул ця технологія раніше була непримінна через швидке руйнування зразків високоенергетичним пучком електронів. Автори нової методики вирішили цю проблему зниженням інтенсивності пучка в 200 разів (порівняно з використовуваними раніше методами електронної дифракції) і скануванням крупиці речовини під безліччю різних кутів (зразок обертається зі швидкістю 0,5 градуса на секунду). Зіграли роль також поява суперчутливих матриць і розробка комп’ютерної програми, що обробляє отримані дані, — структура молекули, зрозуміло, вираховується математичними алгоритмами (так само, як в рентгенокристалографії).

Спочатку ця методика була описана в 2013 році для більш якісного визначення структури білків, заморожених у водному розчині (D. Shi et al., 2013. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals). І ось, через п’ять років, вчені під керівництвом Таміра Гонена (Tamir Gonen), який займався розробкою MicroED, за сприяння групи Браєна Штольца (Brian M. Stoltz) адаптували цю технологію для майже будь-яких нанокристалів невеликих нерозчинених молекул.

Крім прогестерона автори обговорюваної статті визначили структури десятків відомих речовин: лікарських препаратів, вітамінів і натуральних продуктів. Серед них були і досить великі молекули, як, наприклад, тіострептон (thiostrepton, рис. 2). Великі молекули (як білки) повинні бути заморожені у водній матриці, щоб зменшити спонтанний рух груп, що погіршує дозвіл. Кристали невеликих молекул і так досить щільні, тому заморожування в матриці не потрібно. Але чим молекула більша, тим гірше вирішення нового методу.

Ріс. 2. Структура молекули тіострептона, отримана методом MicroED. Атоми вуглецю показані синім, кисню — червоним, азоту — жовтим. Атоми водню не показані, щоб не ускладнювати картину. Малюнок з обговорюваної статті у chemrxiv.org

На вигляд аморфні (без помітних неозброєним оком кристалів) порошки були проаналізовані прямо в тому вигляді, в якому вони були отримані від постачальників, без будь-якої додаткової обробки — їх навіть не завжди треба було подрібнити. Обсяги нанокристалів речовини були в мільярди разів меншими від необхідної для рентгенокристалографії. Автори продемонстрували додаткову перевагу MicroED: завдяки сильній взаємодії електронів з речовиною він часто безпосередньо визначає розташування атомів водню в аналізованій молекулі (набагато частіше, ніж це відбувається при рентгенокристалографії).

Речовини «з коробки», можливо, проходять через кристалізацію — це може бути частиною процедур очищення перед продажем. Тому для кращої демонстрації потенціалу методу автори вирішили перевірити його на речовинах, які не були навмисно кристалізовані, а були тільки що очищені рідинною хроматографією в їх лабораторії. З такими речовинами структура була успішно розшифрована без будь-якої обробки в двох з чотирьох перевірених випадків (молекули (-) — лімаспермідину і оксиндолу).

Рис. 3 демонструє ще одну унікальну можливість, яку надає метод MicroED. Кілька речовин (біотин, цинхонін, карбамазепін і бруцин) змішали, суміш помістили під мікроскоп і протягом декількох хвилин, враховуючи вже отримані дані на індивідуальних зразках, змогли визначити, до якої з чотирьох речовин відноситься кожен окремий нанокристал.

Ріс. 3. MicroED-аналіз суміші суміші кристаликів біотину, цинхоніну, карбамазепіну і бруцину дозволив визначити, де яка речовина, за лічені хвилини. Метод рентгенокристалографії на таке і близько не здатний. Малюнок з обговорюваної статті у chemrxiv.org

Автори сподіваються, що метод незабаром стане стандартним для аналізу і визначення структури речовин у будь-якій хімічній лабораторії. Можливо, скоро сцени хімічного аналізу з поганих (з точки зору відображення «хімічних» реалій) фільмів стануть реальністю.

* * *

Того ж дня була опублікована робота європейської конкуруючої групи дослідників з Німеччини та Швейцарії з дуже схожим методом, який автори поки ніяк не назвали. Як і їхні американські колеги, вони використовують чутливий детектор, але механізму, що поступово обертає кристали, у них немає, і вони їх не заморожують. Замість цього вони вибирали більш великі кристали (мікро- замість нанорозмірних) і сканували тонким пучком електронів різні регіони, щоб зібрати достатню для аналізу кількість сканувань. Такі кристали, хоч і більші, все ще набагато менші, ніж потрібні для рентгенокристалографії в лабораторних умовах.

Своїм методом дослідники проаналізували всього дві молекули. Перша — це молекула парацетамолу. Щоб отримати її структуру автори просто розкрили капсулу з порошком (рис. 4a), який в основному складається не з парацетамолу, а з різних некристалічних (аморфних) наповнювачів.

Ріс. 4. Визначення структури молекули парацетамолу з капсули. a — відкрита капсула; b — кристал парацетамолу побачений у мікроскопі; c — дифракція електронів, відбитих від кристала; d — отримана структура парацетамолу; атоми кисню червоні, азоту — сині, вуглецю — чорні, водню — білі в синіх кружечках. Малюнок зі статті в Angewandte Chemie

За допомогою мікркоскопа побачити мікрокристал (рис. 4b) не склало труднощів, і через 10 хвилин електронною дифракцією (рис. 4c) була отримана структура парацетамолу з воднями і високою роздільною здатністю (рис. 4d). Друга молекула — метиленовий синій — важливий індустріальний барвник, який використовується також у фармацевтиці, з якого важко отримати великі кристали, придатні для рентгенокристалографії.

* * *

Джерело: Christopher G. Jones, Michael W. Martynowycz, Johan Hattne, Tyler Fulton, Brian M. Stoltz, Jose A. Rodriguez, Hosea M. Nelson, Tamir Gonen. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure — препринт на сайті chemrxiv.org.

Див. також:

Robert F. Service. ‘A new day for chemistry’: Molecular CT scan could dramatically speed drug discovery — колонка, присвячена обговорюваній статті на сайті журналу Science.

Григорій Молев