«Новий метод редагування генома акуратніший і ефективніший, ніж CRISPR/Cas9»

Ріс. 1. Хоча методи редагування геному активно використовуються вже кілька років, у них залишається багато недоліків. У новому методі, запропонованому вченими з Гарвардського університету, білок Cas9 працює спільно зі зворотною транскриптазою, а в ДНК робляться тільки однонітеві розрізи, що істотно знижує ризик помилки. Малюнок з сайту news.harvard.edu

Вчені з Гарварду, які вже кілька років розвивають методи редагування геному, опублікували опис нового підходу, який дозволяє робити будь-які однонуклеотидні заміни і більш великі вставки і делеції, але відрізняється від класичного CRISPR/Cas9-редагування більшою акуратністю. Це стало можливим завдяки тому, що новий редактор обходиться без двозчіпкових розрізів ДНК і самостійно добудовує редагований ланцюг. В результаті кількість помилок у нього нижча, а ефективність — вища.

В останні роки технології геномного редагування на основі білкового комплексу CRISPR/Cas9 міцно увійшли в інструментарій молекулярних біологів. З їх допомогою можна вносити потрібні зміни в потрібне місце геному — і ця можливість виявилася неймовірно затребувана. Технології CRISPR/Cas9 знайшлося безліч застосувань, так що в результаті вона стала сприйматися чимось на зразок швейцарського ножа, яким намагаються зробити все, що завгодно: запобігати спадковим захворюванням і ВІЛ (див. статті Виправлені діти і Виправлена редакція), створювати організми з суперздібностями (M. Karageorgi et al., 2019. Genome editing retraces the evolution of toxin resistance in the monarch butterfly), стежити за долею окремих клітин при розвитку (R. Kalhor et al., 2018. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR) і навіть керувати гідрогелем (M. A. English et al., 2019. Programmable CRISPR-responsive smart materials).

Незважаючи на шалену популярність у дослідників, цей метод має свої обмеження. Через них вчені не поспішають переходити від дослідів на тваринах до редагування людських геномів, а поодинокі випадки таких процедур зустрічаються неоднозначно (див. статтю У режимі редагування). Два основних ризики, які супроводжують застосування CRISPR/Cas9 — не відредагувати нічого і відредагувати не те. Так, перший і єдиний на сьогоднішній момент китайський експеримент з редагування нормальних ембріонів виявився, судячи з короткої презентації його автора, не дуже успішний: редагування відбулося не у всіх клітинах і не кожній з двох клітинних копій ДНК, а також виявилися неправильно відредаговані ділянки ДНК. Інші, більш відкриті дослідження на забракованих ембріонах говорять про успішне редагування приблизно в двадцяти відсотках випадків (P. Liang et al., 2017. Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos).

Вирішення зазначених проблем істотно просунуло б цю і без того популярну технологію вперед і зробило б її потенційне застосування в медицині більш безпечним і виправданим. На сьогоднішній день є вже багато модифікацій класичної CRISPR/Cas9-системи, які допомагають знизити ризики, але поки жодна з них не подолала їх повністю.

Один з основних недоліків класичного методу — в ньому використовуються розриви обох ниток ДНК. У системі CRISPR/Cas9 три основні компоненти: направляюча РНК (single-guide RNA, sgRNA) з шматком, комплементарною ділянкою, зразок того, на що треба замінити цю ділянку і власне білок Cas9. Спершу sgRNA зв’язується з ДНК, а слідом фермент Cas9 знаходить цей комплекс і робить на його місці двозчіпковий розріз ДНК. Для клітини двошіпочкові розриви небезпечні і вона намагається їх максимально швидко «зашити». Якщо вчасно підсунути їй зразок, за яким це потрібно зробити, система репарації полагодить розрив за цим лекалом. Але лагодження двозначних розривів не завжди відбувається акуратно, так що їх поява в ході CRISPR/Cas9-редагування пов’язана з ризиком помилок і великою кількістю шлюбу.

У 2017 році Девід Ліу (David Liu) і його колеги з Гарвардського університету запропонували альтернативний метод — так зване «редагування підстав» (base editing). У його основу лягло використання гібридного ферменту, зшитого з мутантного білка Cas9, який вміє різати тільки один ланцюжок ДНК, і ферменту, що модифікує підстави. Цікаво, що цей фермент був створений в лабораторії за допомогою штучної еволюції. Детально про те, як це було зроблено, можна прочитати в новині Методом штучної еволюції створено новий фермент для редагування геномів («Елементи», 31.10.2017). Цим методом можна акуратно робити чотири типи точкових замін нуклеотидів (C-T, G-A, A-G, T-C), але для інших операцій з ДНК він не годиться.

У новій роботі, опублікованій днями в журналі Nature співробітниками тієї ж лабораторії, пропонується просунутий спосіб редагування геномів — тепер можна змінювати досить великі ділянки ДНК, не створюючи при цьому двонітевих розривів. Це стало можливим завдяки кільком змінам існуючих систем редагування геному.

По-перше, зразки редагованої ділянки «як є» і «як треба» тепер об’єднані в одну РНК, яку назвали prime editing extended guide RNA (pegRNA). Сам білок, наречений праймуючим редактором (prime editor, PE), теж модифікований і складається з двох частин (рис. 2): мутантної версії білка Cas9, здатної розплести ДНК і зробити надріз на одному ланцюгу, і пришитої до нього зворотної транскриптази, що дозволяє гібридному ферменту синтезувати ДНК на підставі матриці pegRNA.

Ріс. 2. a — раніше за допомогою «редагування підстав» можна було акуратно полагодити близько 30% відомих шкідливих мутацій, а саме — будь-які транзиції. Новий метод теорії дозволяє виконати це для будь-яких модифікацій в межах 30 нуклеотидів, тобто в 89% випадків. b — комплекс PE складається з шматка білка Cas9, що робить одиничний надріз на ДНК, і домену зворотної транскриптази, здатної синтезувати ДНК по матриці РНК. Малюнок з обговорюваної статті в Nature

Весь механізм роботи нового методу розбивається на кілька етапів, схематично показаних на рис. 3.

Ріс. 3. Етапи роботи комплексу PE з ниткою ДНК. Пояснення в тексті. Малюнок з обговорюваної статті в Nature

Для початку pegRNA і PE повинні утворити комплекс з редагованою ділянкою ДНК. Це відбувається приблизно так само, як зазвичай: гомологічна ділянка pegRNA (зелена на рис. 3) знаходить і пов’язує ДНК з мутантним доменом Cas9 (ліловий), який робить надріз (в «класичному» варіанті CRISPR/Cas9 цю функцію виконує sgRNA).

На наступній стадії вступає шматок pegRNA, що містить виправлену версію редагованої ділянки. Він зв’язується з незайнятою розрізаною ділянкою ДНК. Важливо, що гібридна молекула «РНК + ДНК» може служити затравкою для роботи зворотної транскриптази.

Нарешті, домен зворотної транскриптази (помаранчевий шматок PE) добудовує хвостик ДНК по правильній матриці pegRNA.

У підсумку після дисоціації білків і РНК залишається ДНК з одноланцюжковим розривом і двома хвостами, один з яких містить вихідну, а інший відредаговану версію послідовності (рис. 4). Клітинні системи ДНК повинні вибрати одну з них для того, щоб відновити цілісність ДНК. По ідеї це повинна бути вихідна версія, повністю комплементарна цілому ланцюжку, але незважаючи на це, за основу часто вибирається відредагований шматок. Причина в тому, що вихідний шматок більше схильний до дії ендонуклеази FEN1, яка полює за 5′-хвостами ДНК і руйнує їх.

Ріс. 4. Два варіанти розвитку подій після етапу синтезу ДНК. У першому випадку (вгорі) клітина вважає свіжосинтезований ланцюг неправильним і відновлює вихідну послідовність. У другому випадку (внизу), завдяки роботі ендонуклеази FEN1 і підступно надрізаного протилежного ланцюга ДНК, клітку переконують у «правильності» нового ланцюга, і він виправляє все за його лекалом. Малюнок з обговорюваної статті в Nature

На цьому редагування не закінчується. Хоча розрив успішно зашитий, все одно залишається другий ланцюг ДНК, в якому не відбувалося ніяких змін з самого початку експерименту. Виходить, що два ланцюги ДНК не повністю комплементарні один одному, і знову система лагодження клітинної ДНК повинна це виправити. А для цього вона повинна вирішити, який саме ланцюг взяти за зразок. Щоб змістити вибір на користь відредагованого ланцюга, дослідники пропонують повторювати перший крок процесу: знову зробити надріз на ДНК, але вже на протилежному ланцюгу. Ця штучна поломка дозволяє перехитрити клітку і переконати її, що правильний ланцюг — відредагований.

Всі три етапи редагування — розрізання ДНК, її добудовування і лагодження клітиною — можуть супроводжуватися помилками. Щоб довести ефективність нової методики, Ліу і його колеги провели понад 175 операцій з редагування геному. Для прикладу вони полагодили клітини з культури з мутаціями, що викликають у людей різні захворювання, серед яких серповидноклітинна анемія (потрібна заміна одного нуклеотиду в гені HBB) і хвороба Тея-Сакса (необхідно видалити цілих чотири нуклеотиди в гені HEXA). Крім того, вони модернізували клітини, замінивши одну пуринову підставу на піримідинову в гені PRNP і убезпечивши їх тим самим від пов’язаних з цим геном прионних захворювань.

Автори порівняли новий метод зі старими: «редагуванням підстав» і класичним CRISPR/Cas9 (рис. 5). «Редагування підстав» виявилося більш акуратним при простих замінах, але в більш важких випадках, коли поруч із замінюваною підставою розташовано багато таких же, воно збоїло частіше, ніж новий метод. CRISPR/Cas9 програв йому «за всіма статтями». На прикладі редагування різних клітинних ліній автори показали, що ефективність нового методу сягає 20-50%, а кількість помилок коливається в межах 10%. CRISPR/Cas9-правильно спрацьовувало лише в 3-20% випадків.

Ріс. 5. Порівняння ефективності комплексу PE (вгорі) та редагування з двошіпочковими розривами. Синім показана частка правильно відредагованих ділянок, сірим — помилково відредаговані шматки. Малюнок з обговорюваної статті в Nature

Автори перевірили свою нову техніку на всіх видах точкових мутацій, а також на більш великих вставках (до 44 пар підстав) і делеціях (до 80 пар підстав). Вони підрахували, що їх метод зможе виправити приблизно 89% відомих генетичних варіантів, пов’язаних із захворюваннями, — саме стільки генетичних патологій з бази даних ClinVar лікується відносно короткими змінами ДНК (в межах 30 нуклеотидів).

В цілому, новий метод виглядає дуже перспективно, хоч, зрозуміло, і вимагає перевірки іншими дослідниками. На відміну від CRISPR/Cas9 він не делегує лагодження ДНК неохайній системі репарації клітини, а розрізає лише один ланцюг ДНК і сам же його добудовує. Самостійно клітина лагодить розрив тільки на останній стадії редагування, але це набагато безпечніше, ніж лагодження двозначного розриву: тут задіяна інша, набагато більш акуратна система репарації, яка слідує зазначенню білкового комплексу, який люб’язно вказує їй на неправильний ланцюг.

Джерела:

1) Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa, Luke W. Koblan, Jonathan M. Levy, Peter J. Chen, Christopher Wilson, Gregory A. Newby, Aditya Raguram & David R. Liu. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4.

2) H. Ledford. Super-precise new CRISPR tool could tackle a plethora of genetic diseases // Nature. 2019. (Популярний синопсис до обговорюваної статті).

Віра Мухіна