Паучий випадок

Мне бы только

мой крошечный вклад внести,

За короткую жизнь спл

Хотя бы ниточку шелка

…

У ці осінні дні, погнавшись у лісі за необережним грибом, ми цілком можемо потрапити в ловчі мережі павука. Звичайно, ці мережі нас не втримають, ми зруйнуємо ажурне плетіння — плід праці арахніда і, струшуючи павутину з обличчя, рук або одягу, незадоволено скажемо що-небудь на кшталт: «Понавішали тут мереж». Разом з тим, напевно, варто здивуватися еволюції, яка створила павука і його павутину — міцну і еластичну. Це настільки вдалий матеріал, що вже зараз його починають застосовувати люди, і не тільки в трансплантаційній медицині, — з неї навіть роблять спортивне взуття. Компанії, що виробляють тонни павутини (точніше, білків, що входять до її складу), ростуть як гриби.

Найміцніша серед еластичних

Волокна павутини відрізняються винятковими механофізичними властивостями. Завдяки міцності на розрив і пружності вони можуть поглинати багато енергії, не руйнуючись. Якщо взяти однакові за масою зразки білка павутини і синтетичного араміда — кевларових волокон, виявиться, що кевлар до руйнування зможе поглинути втричі менше енергії. У складі фібрилярного білка павучого шовку основні амінокислотні залишки — гліцин, аланін і серін. Міцність та еластичність мікрометрових каркасних ниток павутини (тобто радіальних, на відміну від менш міцних спіральних) пояснюється тим, що всередині них є жорсткі білкові кристали розміром у кілька нанометрів, поєднані між собою еластичними пептидними зв’язками. Гранична напруга на розрив каркасної нитки звичайного хрестовика Araneus diadematus — 1,1-2,7 ГПа. Для порівняння: межа міцності стали 0,4-1,5 ГПа, людського волосся — 0,25 ГПа. І звичайний шовк поступається павучому за цим показником. Звичайно, павутину не можна назвати ні найміцнішим, ні найбільш еластичним матеріалом, але ці властивості в ній ідеально збалансовані.

Ще 15-20 років тому в світі існувало не більше десяти дослідницьких груп, які вивчали властивості білків павутини і особливості їхньої освіти. Зараз таких команд вже кілька десятків, а практичне застосування павутини в реальному житті наближають три успішно працюючі біотехнологічні компанії. Дослідники вже розкрили, як павуки прядуть павутину, встановили особливості її складу, і ці деталі дозволяють знаходити нові області застосування павутини — від регенерації нервової тканини до способів упаковки споживчих товарів і розробки нових клеєвих складів. Медиків павучий шовк приваблює не тільки ідеальним поєднанням міцності та еластичності, а й тим, що практично не викликає імунної відповіді. Білки павутини застосовуються і в біохімічних лабораторіях — їх ланцюжки можна модифікувати низькомолекулярними сполуками, надаючи білкам особливі властивості.

Перетворення такого складного матеріалу, як білки-спідроїни, на волокна — нетривіальне завдання для хіміків і технологів. Фото: AMSilk

Основні компанії, що ведуть розробки в цій області і вже виробляють продукт, — утворені в 2008-2009 роках німецька AMSilk, японська Spiber і американська (каліфорнійська) Bolt Threads. Зазвичай від появи нової хімічної компанії, що створює принципово нові хімічні продукти, до їх виходу на ринок і початку продажів проходить набагато більше часу.

Від косметики до хірургії

Арахнофоби можуть не турбуватися. Підприємства з виробництва штучної павутини несхожі на павучі ферми, там взагалі немає павуків та інших членистоногих. Замість них «плетінням павутини» займаються трансгенні організми, які містять гени, що керують експресією білків павутини, головним чином бактерії і дріжджові грибки. Хоча шовк павутини виробляють і організми, від яких цього ніяк не очікуєш; наприклад, існує стадо генетично модифікованих кіз у півсотні голів, які дають молоко з білками павучого шовку. З одного літра молока такої кози можна виділити до 4 грамів цих білків; втім, бактерії та грибки виявилися більш ефективними «ерзац-павуками».

Наприклад, компанія AMSilk застосовує генно-модифіковані версії E. coli. Бактерій вирощують у великих чанах для ферментації, потім клітини руйнують і виділяють білок павучого шовку у вигляді білого порошку, який потім може бути гранульований, перетворений на гідрогель або на волокна, — виробники біосинтетичної павутини реалізують свою продукцію у всіх трьох формах.

Унікальні властивості павучого шовку сприяють його комерційному застосуванню. У пробірках гідрогелі на основі павучого шовку (зліва і в центрі), порошок з білків павучого шовку (справа). Фото: AMSilk

Один з напрямків діяльності AMSilk — косметичні засоби Silkbeads і Silkgel з білками павучого шовку, які забезпечують шкірі дихаючий захист від бактерій і шкідливих речовин в навколишньому середовищі. Біосинтетичний павучий шовк часто рекламують як «веганський шовк» — спеціально для тих, хто вважає неприйнятним вбивство окуклившихся гусениць тутового шовкопряду (мабуть те, що для отримання біосинтетичної павутини доводиться умертвляти E. coli, не вкидає веганів в тугу).

Для косметологів біосинтетична павутина хороша тим, що її білки не викликають імунної відповіді і на їх поверхні погано ростуть і розмножуються бактерії. Ще важливіші ці властивості для біомедицини, а зумовлені вони первинною структурою білків. Волокна шовку павутини складаються зі спідроїнових білків, які містять повторювані пептидні послідовності, обрамлені неповторними, індивідуальними доменами, більше половини амінокислотних залишків в яких припадає на гліцин. Можливо, саме високий вміст гліцинових залишків у зовнішніх доменах спідроїнів (інші амінокислотні залишки знаходяться всередині структури білків павутини) і робить павучий шовк біосумісним. Справа в тому, що гліцин — найменша амінокислота, її бічна група, яка не бере участі в утворенні білкового ланцюжка, складається з одного атома водню, і це знижує ймовірність участі залишків гліцину в хімічних реакціях і міжмолекулярних взаємодіях. Саме тому клітини не можуть зв’язуватися зі спідроїнами, і тому біотехнологічний павучий шовк наносять на поверхню медичних пристроїв, щоб спідроїни забезпечували їм біологічний захист.

Дослідники з AMSilk повідомляють про експерименти, в яких білки павучого шовку наносили на катетери з поліуретану, полістиролу, поліетилену, а також на метали і кераміку для імплантатів. Виявилося, що таке покриття забезпечує хороший антибактеріальний захист і знижує ризик ускладнень при використанні полісилоксанових (силіконових) імплантатів (Philip H. Zeplin et al. Spider Silk Coatings as a Bioshield to Reduce Periprosthetic Fibrous Capsule Formation // Advanced Funcional Materials, 2014, 24, 2658–2666; doi: 10.1002/adfm.201302813). На покритті з біотехнологічної павутини бактеріальні біоплівки ростуть гірше, ніж на тефлоні і сталі.

Вирощування біологічних тканин

Тезка японської компанії Spiber — шведська Spiber Technologies ще не може похвалитися продуктами, виведеними на ринок, вона знаходиться на стадії дослідно-конструкторських розробок і отримує білки тільки в грамових кількостях. Біотехнологи цієї компанії ввели E. coli лише частину гена, відповідального за вироблення спідроїнів, так що бактерії виробляють білки розмірами близько однієї десятої від довжини нативних білків павучого шовку. З цих білків збираються виготовляти сітчасті або пористі каркаси для спрямованого вирощування стовбурових клітин, реконструкції кісткової тканини і загоєння ран. У подібних матрицах вже успішно культивували клітини ссавців. Нещодавно шведські дослідники модифікували свої «будівельні ліси» з шовку, надавши їм мотив зв’язування, характерний для глікопротеїду фібронектину, і виявили, що з таким модифікованим шаблоном клітини шкіри зв’язуються ефективніше (Widhe M. et al. A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices // Biomaterials, 2016, 74, 256–266; doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.10.013).

Зазвичай клітини культивують на плоскій поверхні, однак для вирощування більшості органів і тканин необхідні об’ємні каркаси. Тривимірні пористі системи з укорочених спідроїнів з впровадженими в них активаторами росту клітин імітують матрикс тканини і «обманюють» клітини, змушуючи їх рости в потрібному напрямку.

Наприклад, дослідники вчаться вирощувати таким способом невеликі ділянки тканини підшлункової залози, необхідні для лікування діабету. Матриці з павучого шовку in vitro можуть підтримувати стабільність колоній клітин підшлункової залози людини протягом трьох місяців (Johansson U. et al. Pancreatic Islet Survival and Engraftment Is Promoted by Culture on Functionalized Spider Silk Matrices // PLoS One, 2015, 10, e0130169; doi: 10.1371/journal.pone.0130169). Тривимірна матриця не тільки забезпечувала життєздатність клітин, але й сприяла тому, що вони реагували на стимуляцію глюкозою, виробляючи інсулін. З часом тканина збільшувалася в обсягах, і в ній формувалося більше судин (Shalaly N. D. et al. Silk matrices promote formation of insulin-secreting islet-like clusters // Biomaterials, 2016, 90, 50–61, doi: 10.1016/j.biomaterials.2016.03.006), що підвищує шанси на успішну трансплантацію.

Лабораторія Анни Різінг, яка працює у співпраці зі Spiber, з Королівського Каролінського університету Швеції використовує модель ex vivo для вивчення особливостей регенерації тканини спинного мозку в присутності павучого шовку. Дослідження показали, що тканина периферичного нерва вівці успішно зростала на напрямних з павучого шовку (Widhe M. et al. Invited review current progress and limitations of spider silk for biomedical applications // Biopolymers, 2012, 97, 6, 468–478, doi: 10.1002/bip.21715; Rising A. Controlled assembly: a prerequisite for the use of recombinant spider silk in regenerative medicine? // Acta Biomaterialia, 2014, 10, 4, 1627–1631, doi: 10.1016/j.actbio.2013.09.030).

Наслідуючи природу

Павук пряде павутину за допомогою спеціальних павутинних залоз — нитки утворюються з висококонцентрованого розчину білка, з цього розчину самка павука може звити до семи типів волокон. Нещодавно в лабораторії Різинг отримали рекомбінантні білки павучого шовку, які мають не тільки аналогічні натуральним білкам повторювані послідовності, але також N- і С-кінці, характерні для павучого спідроїну (Andersson M. et al. Silk Spinning in Silkworms and Spiders // International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17, 8, pii: E1290. doi: 10.3390/ijms17081290). В даний час N- і С-кінці більшої частини біотехнологічних спідроїнів не такі, як у природних, а між тим ряд вчених, наприклад Томас Шайбель з Байройтського університету, вважають, що саме початок і кінець ланцюга критично важливі для утворення міцних волокон з водного розчину (Schacht K. et al. Biofabrication of cell-loaded 3D spider silk constructs // Angewandte Chemie Int. Ed., 2015, 54, 2816–2820; doi: 10.1002/anie.201409846).

Зараз більшість лабораторних способів, що дозволяють перетворити білки павучого шовку на волокна, засновані на застосуванні гексафторизопропанолу — токсичного розчинника, який не тільки небезпечний, але ще може повільно руйнувати білки і має високу собівартість. Все це виключає можливість його промислового застосування. Нещодавно був опублікований метод, що дозволяє розчиняти спідроїни в чистій воді і отримувати з них волокно (Jones J. A. et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials // Biomacromolecules, 2015, 16, 1418–1425; doi: 10.1021/acs.biomac.5b00226). Розчин для прядіння волокон можна зробити за допомогою мікрохвильової печі, передбачається, що розчинення забезпечується впливом температури і тиску. Компанії, що розробляють методи прядіння волокон з павучого шовку, придумують свої підходи, які не публікують у відкритому друку, але і вони воліють тягнути штучну павутину з водного розчину, мінімізуючи застосування дорогих і небезпечних розчинників.

Лабораторний протокол обробки біотехнологічного павучого шовку передбачає процедуру осадження-висалювання білків, причому вони денатурують. Потім обложений і денатурований білок формують у волокнисту структуру із суспензії у водно-спиртовому розчині. Окремі волокна можна звити в нитки, що містять від восьми до двадцяти чотирьох жив, — такі нитки вже підходять для практичного застосування. Але компаніям необов’язково прясти павутину — для нанесення покриттів простіше використовувати біотехнологічні спідроїни у вигляді порошку або гідрогелю. Підраховано, що кілограма павутинних білків вистачить на антибактеріальні і ^ агулюючі покриття для декількох мільйонів (від одного до десяти — залежить від розміру) катетерів. Є надія, що до кінця 2017 року таке медичне обладнання закінчать тестувати на тваринах, у найближчі 5 років деякі його зразки пройдуть сертифікацію Управління з контролю продуктів харчування та лікарських засобів США (FDA) і почнуть застосовуватися в клінічній практиці.

Костюм Спайдермена

Штучні спідроїни застосовують не тільки в біомедицині. Вже згадувалося, що міцність павучого шовку на розрив вище, ніж у кевлара, але, на жаль, здатність еластично деформуватися у відповідь на механічне навантаження не дозволяє розглядати чисті спідроїни в якості матеріалу для «натуральних» бронежилетів. Кулю бронежилет з павучого шовку зловить і зупинить, але до того моменту вона, швидше за все, вийде з тулуба або застрягне у внутрішніх органах разом з «бронежилетом». Перевага арамідних волокон, з яких роблять кевлар, полягає якраз у тому, що вони не деформуються. Проте композити спідроїнів з арамідами або вуглеволокном цілком підходять для виготовлення гнучких і міцних конструкційних елементів автомобілів або безпілотних літальних апаратів. Існують композиції рекомбінованого павучого шовку з керамічними наночастинками, які можуть блокувати гази і пари води, отримуються ідеальні матеріали для упаковки харчових продуктів (Doblhofer E. Structural Insights into Water-Based Spider Silk Protein — Nanoclay Composites with Excellent Gas and Water Vapor Barrier Properties // ACS Applied Materials and Interfaces, 2016, 8, 25535–25543; doi: 10.1021/acsami.6b08287). У їх виробництві не використовуються токсичні речовини, білки розчиняють у воді, а сам композит прозорий і біорозкладаємо.

Ще одна важлива перевага павучого шовку — він не плавиться. Тому текстиль з павучих ниток, натуральних або отриманих біотехнологічно, цікавить творців армійської екіпіровки. Під впливом високих температур, наприклад спалахів світлошумових і бойових гранат, нейлонові ремінці каски та інших елементів одягу сучасних солдатів можуть розплавитися, а то і приплавитися до шкіри, заподіявши серйозні опіки. Волокна і текстильні вироби зі штучної павутини просто обвуглюються, що знижує ризик додаткового температурного впливу на шкіру — саме це і цікавить військових, готових платити більше для забезпечення безпеки особового складу. Поки що вартість біосинтетичної павутини висока, і серед одягу доступної цінової категорії навряд чи найближчим часом можна буде знайти річ з ярличком «spider silk» (товари з AliExpress не в рахунок, про них виробники можуть написати що завгодно). Однак дві компанії все ж ризикнули вивести на ринок одяг з біотехнологічних спідроїнів.

Штормівка The North Face з рекомбінованого павучого шовку. Фото: Uncrate

Так, у вересні 2015 року компанія з виробництва спортивного одягу для активного відпочинку The North Face почала рекламувати і випробовувати куртку-штормівку з рекомбінованого павучого шовку. Перші зразки обіцяють випустити вже в цьому, 2017 році. Вони будуть виготовлені з павучого шовку від японської компанії Spiber. Представники компанії запевняють, що їм вдалося знизити витрати на виробництво спідроїнових волокон до ста доларів за кілограм. Однак щоб тканини з синтетичної павутини перестали бути приділом обраних, собівартість виробництва пряжі повинна стати хоча б такою ж, як у натурального шовку тутового шовкопряда (30-70 доларів за кілограм, залежно від якості). Компанія Spiber сподівається, що ця мета цілком досяжна, її конкуренти теж так вважають, розробляючи все більш дешеві технології.

Так, вже згадувана німецька компанія AMSilk використовує білки біосинтетичного павучого шовку для виготовлення волокон під торговою назвою Biosteel («Біосталь»). Керівництво AMSilk впевнене, що з цього волокна робитимуть взуття і одяг, а також текстиль для оздоблення крісел автомобілів і літаків. У 2014 році фірма «Адідас» представила лінію спортивного тренувального взуття, зробленого практично цілком (крім підошви) з волокон Biosteel.

Німецька компанія AMSilk виробляє волокно з синтетичного павучого шовку Biosteel, це волокно використовувалося для виготовлення тренувального спортивного взуття

Таким чином, липка лісова павутинка пройшла довгий шлях, і тепер з неї плетуть міцні мережі нові хімічні компанії, які зуміли налагодити виробництво всім відомого природного матеріалу і знайшли йому безліч застосувань. Можливо, через десять років виробництво біосинтетичної павутини розвинеться настільки, що ми будемо питати консультантів у магазині одягу, з якого саме натурального шовку ця кофточка — шовкопрядного або павучого. Природно, спідроїни шовку будуть і далі оплітати своїми мережами хірургію, регенеративну медицину, а також нові області, про які ми поки і не підозрюємо. Дивишся, з’явиться пристосування, здатне вистрілювати ниткою біосинтетичної павутини, щоб лазити по стінах або іммобілізувати недоброзичливців, — і, головне, робити це можна буде, не чекаючи укусу радіоактивного павука-мутанта.