Під дією бактерицидних антибіотиків бактерії вбивають себе самі

Ріс. 1. Загальний механізм дії бактерицидних антибіотиків. Дія трьох різних видів бактерицидних антибіотиків — аміноглікозидів, лактамів і фторхінолонів на відповідні мішені в клітці призводить до підвищеного рівня окислення NADH в дихальному ланцюгу. При гіперактивації дихального ланцюга утворюються активні форми кисню, наприклад, супероксид, що пошкоджують залізовмісні білки. Вивільнення іона заліза призводить до каталітичного утворення гідроксил-радикалів, що пошкоджують всі основні структури клітини — ліпіди, ДНК і білки. Зображення з огляду Kohanski et al. в Nat Rev Microbiol

Став відомий загальний механізм, що лежить в основі бактерицидної дії більшості застосовуваних в даний час антибіотиків. Стимульоване антибіотиками утворення вільних радикалів призводить до накопичення критичної кількості пошкоджених гуанинових підстав у складі ДНК і РНК; спроба клітини виправити завдану шкоду призводить до загибелі.

Вже понад 50 років людство застосовує антибіотики, завдяки чому практично позбавлене від колишньої небезпеки бактеріальних інфекцій. Антибактеріальні препарати діляться на два класи: бактерицидні, які активно вбивають бактерій з майже 100% ефективністю, і бактеріостатичні, які просто зупиняють зростання культур.

До бактерицидних антибіотиків належать ^ ‑ лактами (пеніцилін, амоксицилін та ін.), блокуючі синтез пептидоглікану — основного компонента бактеріальної клітинної стінки; фторхінолони (ципрофлоксацин), що блокують бактеріальну топоізомеразу II в процесі роботи і тим самим викликають невисстановлювані двозначні розриви в ДНК; аміноглікозиди (канаміцин), що зв’язуються з 30S суб’єдиницею бактеріальної рибосоми та інгібують трансляцію.

Більшість інших інгібіторів трансляції (хлорамфеникол, спектиноміцин, тетрациклін та ін.) надає бактеріостатичну дію.

Більшість антибіотиків роблять одне з трьох: або порушують трансляцію білка, або інгібують процеси синтезу і підтримки структури клітинної стінки, або порушують реплікацію і репарацію ДНК. Завдяки відмінностям фізіологічних процесів і структури конкретних білків у прокаріот і у еукаріот антибіотики є порівняно нетоксичними для людини. Взаємодії антибіотиків і їх мішеней в деталях вивчені, і положення молекули ліків в активному центрі ферменту відомо аж до окремого атома. Здавалося б, що залишилося незрозумілого? Тим не менш, за роки вивчення і застосування антибіотиків накопичилося безліч різних фактів, що свідчать про те, що ми примітивно уявляємо собі процес загибелі клітини. Наприклад, виявилося, що бактерицидна дія фторхінолонів вимагає активного синтезу АТФ і наявності синтезу білка. Мутації в системі SOS-відповіді (відповіді на пошкодження ДНК) підвищують бактеріальну чутливість до фторхінолонів, і, що вже зовсім дивно, до пеніцилін. Нарешті, залишалося незрозумілим, чому одні інгібітори трансляції (аміноглікозиди) призводять до швидкої смерті бактерій, в той час як інші (хлорамфеникол, спектиноміцин) просто зупиняють зріст клітин.

У 2007 році вчені з Бостона під керівництвом Джеймса Коллінза (James Collins) поставили перед собою амбітне завдання з’ясувати, як, власне, інгібування клітинних ферментів призводить до загибелі клітин. Для цього вивчалася зміна транскрипції всіх генів Escherichia coli у відповідь на дію антибіотиків. Несподівано для всіх виявилося, що дія всіх трьох класів бактерицидних антибіотиків (фторхінолони, аміноглікозиди, лактами) призводить до активації одних і тих же груп генів: відповідальних за метаболізм заліза, боротьбу з окислювальним стресом і репарацію ДНК. Дослідники припустили, що пошкодження залізо-сірчаних кластерів у складі ферментів дихального ланцюга і вивільнення вільних іонів заліза провокує радикальну реакцію за участю пероксиду водню, в ході якої лавиноподібно збільшується кількість гідроксил-радикалів OH·, що пошкоджують ДНК, білки і мембрани клітини.

Залізо-сірчані кластери — це комплекси пов’язаних дисульфідними зв’язками атомів заліза, які містяться в активних центрах багатьох ферментів, що здійснюють окислювально-відновлювальні реакції в клітці, наприклад, аконітази, NADH-дегідрогенази, нітроредáази.

У Фентонівській реакції, що описує взаємодію іонів заліза і пероксиду водню, сумарний ступінь окислення заліза не змінюється, таким чином, він є каталізатором утворення вільних радикалів:

Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + ·OH + OH⁻

Fe³⁺ + H₂O₂ → Fe²⁺ + ·OOH + H⁺

Перекис водню, що бере участь у реакції, постійно утворюється в клітці в процесі аеробного дихання.

Дійсно, застосування речовин — загарбників радикалів, таких як тіомочевіна, дозволило значно знизити загибель клітин під дією антибіотиків; аналогічні результати були досягнуті, коли за допомогою мутацій була порушена здатність клітин синтезувати потенційно небезпечні залізо-сірчані кластери. Подальші дослідження показали, що дестабілізація залізо-сірчаних білків у свою чергу викликається супероксид-аніоном O₂ ‑, який виділяється в ході гіперактивації дихального ланцюга. Мабуть, спроби клітини компенсувати первинну дію антибіотиків призводять до різко збільшеного вироблення АТФ, що і викликає окислювально-відновлювальний дисбаланс, що виявляється в кінцевому рахунку для неї смертельним (більш детальна схема зображена на рис. 1).

Цього квітня в журналі Science вийшла стаття біологів з Массачусетського технологічного інституту (MIT) під керівництвом Грема Вокера (Graham Walker), яка продовжує і доповнює роботи Коллінза, що підтвердилося участю останнього в публікації.

Група Вокера займається вивченням ДНК-полімерази E. coli DinB (про більш ранню їх роботу вже виходила стаття на «Елементах», див. пояснений механізм копіювання збійних блоків в ДНК, «Елементи», 19.01.2006). DinB — це полімераза транслезійного синтезу (див. translesion synthesis), здатна працювати на пошкоджених ДНК-матрицах (наприклад, містять окислені нуклеотиди, або тимінові дімери (див. thymine dimer), що є нездоланною перешкодою для основної ДНК-полімерази E. coli — ДНК III. dinB є життєво важливим для клітини геном, що дозволяє переживати стрес. Проте штучне збільшення кількості копій DinB («надекспресія») є смертельним для бактерії. Вокер і його колеги вирішили перевірити, чи не є загибель клітини і в цьому випадку залежна від гідроксил-радикалів. Для цього вони проводили надекспресію DinB або в присутності «загарбника» вільних радикалів, тіомочевіни, або в присутності хелатора іонів заліза 2,2 «‑ дипиридила, або в анаеробних умовах. Виявилося, що будь-яке з цих хитрощів здатне повністю запобігти загибелі клітин.

Однією з важливих потенційних мішеней активних форм кисню є азотиста основа гуанін. Окислений гуаніновий нуклеотид, 8 ‑ оксо-дезоксигуанідин (8 ‑ oxo ‑ dG), є джерелом мутацій: він здатний утворювати комплементарні пари як з С (цитозином), так і з А (аденином) (неушкоджений нуклеотид G в нормальних умовах утворює пари тільки з С). У свою чергу, полімераза DinB, володіючи зниженою точністю копіювання, здатна використовувати окислений 8 ‑ оксо-дезоксигуанідтрифосфат (8 ‑ oxo ‑ dGTP) як субстрат, вставляючи його навпроти А або навпроти С. Можливо, при надекспресії DinB включає надто багато 8 ‑ oxo ‑ dG до складу ДНК, і клітина гине від занадто великого числа мутацій? Вчені створили штучну форму DinB, в якій заміна однієї амінокислоти значно знижує можливість використання 8 ‑ oxo ‑ dGTP в якості субстрату. Як і передбачалося, надекспресія такої полімерази безпечна для клітин.

Тим не менш, безпосередня мутагенна дія не може пояснити спостережуваної швидкості загибелі клітин: DinB синтезує ДНК дуже повільно, і шанс, що достатня кількість клітин отримає летальну мутацію за час експерименту, що триває кілька годин, дуже невеликий. Швидше за все, причина не в самих мутаціях, а в спробах клітини їх виправити: винна система ексцизійної репарації (див. base excision repair), відповідальна за розпізнавання і видалення пошкоджених підстав. Якщо два окислених гуанінових нуклеотиди розташовані поруч один з одним, дія ферментів-глікозилаз MutM і MutY може призвести до утворення дволіпочкового розриву ДНК (рис. 2). Дійсно, виявилося, що видалення цих двох генів допомагає клітинам виживати при надекспресії DinB. Іншим способом майже повністю захистити клітини від загибелі було одночасно з DinB надекспресувати фермент MutT, здатний дізнаватися пошкоджений 8 ‑ oxo ‑ dGTP ще до того, як він вбудується в ДНК, і гідролізувати його.

Ріс. 2. Полімераза DinB (Pol) здатна включати окислені гуанінові нуклеотиди (GO) до складу ДНК. Якщо вони вбудуються на невеликій відстані один від одного, подальша дія ферментів репарації MutM і MutY призведе до утворення потенційно летального двозчіпкового розриву ДНК. Ситуація на картинці справа виникає, коли DinB включає 8 ‑ oxo ‑ dG навпроти вже існуючого пошкодження на іншому ланцюгу. Зображення з супровідних матеріалів (PDF, 877 КБ) до обговорюваної статті Foti et al., Science

Який же зв’язок між цими відкриттями і бактерицидною дією антибіотиків? Виявляється, токсична дія· ОН ‑ радикалів, що утворюються при дії антибіотиків, в основному пов’язана саме з окисленням гуаніну. Так, надекспресія MutT здатна на кілька порядків збільшити виживаність клітин, що зазнали дії фторхінолону, норфлоксацину, пеніциліну або канаміцину. До схожих результатів призводить «вибивання» генів двох полімераз, здатних включати до складу ДНК 8 ‑ oxo ‑ dG (DinB і UmuDC) або генів глікозилаз MutM і MutY, що репарують пошкоджену основу. Таким чином, довгий шлях до встановлення справжніх причин загибелі клітин під дією антибіотиків майже пройдено; практичне застосування отриманих знань дозволить, як сподіваються вчені, значно посилити потенціал існуючих антибіотиків і подолати резистентність, що виникає у мікроорганізмів.

Джерело: James J. Foti, Babho Devadoss, Jonathan A. Winkler, James J. Collins, Graham C. Walker. Oxidation of the guanine nucleotide pool underlies cell death by bactericidal antibiotics // Science. 2012. V. 336. Pp. 315–319.

Див. також:

1) Daniel D. Dwyer, Michael A. Kohanski, Boris Hayete, James J. Collins. Gyrase inhibitors induce an oxidative damage cellular death pathway in Escherichia coli // Mol Syst Biol. 2007 V. 3. P. 91.

2) Michael A. Kohanski, Daniel J. Dwyer, Boris Hayete, Carolyn A. Lawrence, James J. Collins. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics // Cell. 2007. V. 130. Pp. 797–810.

3) Michael A. Kohanski, Daniel D. Dwyer, James J. Collins. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks // Nat Rev Microbiol. 2010. V. 8. Pp. 423–435.

Дмитро Гіляров