Поверхня молекули — джерело біологічної інформації

Про авторів

Численні процеси, що відбуваються в кожній окремо взятій клітці живого організму, засновані на виборчому контакті одних молекул з іншими: ферментам вдається знайти потрібні субстрати, ліганди «впізнають» свої мішені. На цій разюче чіткій системі ґрунтується вся молекулярна біологія, а значить, і життя взагалі. Генетична програма реалізується у формі хитромудрих багатоклітинних організмів за рахунок розпізнавання біомолекулами один одного, до того ж воно визначає саму можливість існування такої програми. Дивовижна складність живих організмів не «записана» в ДНК буквально (адже там не задані, наприклад, координати всіх атомів тіла), а виходить ніби сама собою, завдяки самоорганізації і «свідомому вибору» одними молекулами інших.

Так, ДНК і РНК-полімерази з дуже високою точністю розпізнають матрицю — молекулу нуклеїнової кислоти, яка на перший погляд однакова у всіх місцях і схожа на моток однорідного дроту, проте відрізняється послідовністю нуклеотидів. Матрична РНК, за допомогою якої закодована в ДНК інформація перетворюється, припустимо, в білок-рецептор, безпомилково дізнається рибосомою і численними факторами ініціації, елонгації та термінації трансляції. Подовження поліпептидного ланцюжка на кожен новий амінокислотний залишок відбувається внаслідок розпізнавання триплету молекулою транспортної РНК. Якщо білку судилося стати секретованим або мембранним (тобто йому потрібно потрапити з цитоплазми, де працює синтезуюча його рибосома, в інше місце), він містить спеціальну сигнальну послідовність, завдяки якій його надсилають за потрібною «адресою». Подібних взаємодій у кожній клітині незліченна безліч.

Ріс. 1. Схематичне зображення трьох типів молекулярної поверхні — вандерваальсової (що проходить по «контуру» атомів), доступної розчиннику і Конноллі (які отримуються за допомогою алгоритму «коться сфери» радіусом r)

Процес розпізнавання невіддільний від поняття молекулярної поверхні. Саме вона, являючи собою своєрідну зону комунікації, визначає, чи «підійдуть» учасники контакту один одному. Мірою такого розпізнавання служить вільна енергія взаємодії, а викликана ним передача сигналу відбувається через електронно-конформаційні переходи, що призводять після утворення комплексу до зміни просторового розташування атомів та/або властивостей молекул. Очевидно, що їхня поверхня — абстракція, оскільки звичайні фізичні поверхні (наприклад, води або металу) перестають існувати при переході до атомарного масштабу. Однак молекулярна поверхня, представлена у вигляді сукупності сфер, що зображують окремі атоми, або якимось подібним чином, — дуже зручний інструмент для опису відповідних взаємодій. Комп’ютерне моделювання біологічних молекул часто засноване не на квантовій механіці, що описує будову речовини максимально коректно, а на наборі наближень, що відводять від фізичних «витоків», але дозволяють за допомогою ЕВМ вирішувати важливі практичні завдання: шукати нові ліки або вивчати механізми розвитку захворювань. Одне з таких спрощень — концепція молекулярних поверхонь, що представляє молекулу у вигляді твердого тіла з розподіленими на ньому фізико-хімічними властивостями.

Типи і застосування молекулярної поверхні

Рис, 2. Поверхня Ван-дер-Ваальса знайома нам за масштабними макетами молекул у вигляді різнокольорових сфер. На фотографії прославлений молекулярний біолог Джеймс Вотсон з моделями подвійної спіралі ДНК [1]

Утворюючі молекулу атоми, строго кажучи, не можна представляти у вигляді кульок — вони не мають чітко вираженого зовнішнього кордону і більш ніж на 99% складаються з «порожнечі» (згадаймо характерні розміри протона, нейтрона і електрона і порівняємо з розмірами утворених ними структур). Втім, у практичних цілях вважати атоми твердими сферами виявилося зручно. Вперше це зробив голландський вчений Ян Дідерік Ван-дер-Ваальс, і з тих пір саме його ім’я носить середній ефективний радіус атома, що змінюється в межах 1-2 ^ для різних хімічних елементів. По суті, це половина мінімальної відстані, на яку можна зблизити (без утворення хімічного зв’язку) два однакових атома, що належать різним молекулам. Вандерваальсова поверхня складається з точок, які лежать на уявних сферах (атомах), не потрапляючи всередину сусідніх (рис. 1). Вона складає основу поширеного «молекулярного конструктора» Корі — Полінга — Колтуна, що використовує відоме всім зі школи колірне позначення атомів різних хімічних елементів (рис. 2). Вандерваальсова модель молекули всередині рясніє порожнечами і може містити наскрізні просвіти. У ній багато вільного місця, як у мішку з ялинковими кулями, в який, однак, ще один вже не додаєш. Молекули розчинника (найчастіше води) не можуть проникнути в ці невеликі порожнини. Це привело вчених до концепції поверхні, доступної розчиннику. Запропонована в 1971 р. Б. Лі і Ф. М. Річардсом, вона розраховується математично як безліч точок, рівновіддалених від вандерваальсової поверхні молекули. Доступна розчиннику поверхня описана центром сферичної молекули води (ефективний радіус 1,4 ^), «прокатаної» навколо атомів (див. рис. 1). А ось нижні межі кульок води, що знаходяться в контакті з цільовою молекулою, складають поверхню Конноллі (див. рис. 1). Вона виходить винятком з обсягу точок, в які може потрапити розчинник. Саме цей тип поверхні переважно використовується для візуалізації молекул і для розрахунку їх фізико-хімічних властивостей (рис. 3, 4).

Рис, 3. Фермент аспартаткарбамоілтрансферазу з оригінальної статті М. Конноллі [2]

Найчастіше до молекулярної поверхні вдаються, щоб вирахувати полярну і неполярну складові її площі. Їх співвідношення визначає вільну енергію перенесення з однієї фази (наприклад, неполярної) в іншу (полярну) даної молекули і, відповідно, ступінь її гідрофобності або гідрофільності. Так званий гідрофобний ефект бере участь у згортанні біополімерів, які прагнуть екранувати свої «водобоязливі» фрагменти від полярного розчинника (або навпаки, якщо йдеться про мембранні білки), оскільки контакт води з неполярними речовинами термодинамічно невигідний *.

Процес формування просторової структури (фолдинг) безпосередньо пов’язаний з поверхневими явищами і мінімізацією площі контакту деяких фрагментів гнучкого білкового ланцюжка з навколишнім середовищем. Як і географічну карту, почесне зображення поверхні молекули можна зробити інформативним, завдавши на нього різні фізико-хімічні характеристики та/або особливості структури. Наприклад, часто проводять розрахунок і колірну візуалізацію електростатичного потенціалу, що визначає зарядові взаємодії. Або картують молекулярний «рельєф» поверхні — розташування «ущелий», «пагорбів» і «рівнин», що наочно показують гладкість або шорсткість на тій чи іншій ділянці. Разом з локалізацією на «карті» позицій донорів і акцепторів водневого зв’язку це визначає знаходження сайтів пов’язаної води — місць, де розчинник затримується особливо довго. Безумовно, форма поверхні та її властивості змінюються разом з конформацією молекули (через теплові коливання атомів або міжмолекулярні взаємодії). Тому поверхня молекули — її своєрідний динамічний «портрет», до якого можна додати ще й тимчасову компоненту. Зібравши велику колекцію таких «портретів» (наприклад, в результаті розрахунку молекулярної динаміки), можна створити усереднену карту поверхні, а також виявити на ній найбільш статичні і рухливі області. Так можна наочно зобразити, наскільки гнучкими або жорсткими можуть бути в даних умовах окремі ділянки молекули. Одне з найактуальніших застосувань концепції молекулярних поверхонь в сучасній комп’ютерній біології — докінг (стикування), метод, що пророкує найбільш вигідну для утворення стійкого комплексу орієнтацію і положення однієї молекули по відношенню до іншої. З позицій молекулярної біології це дозволяє реконструювати частину естафети розпізнавання і передачі сигналів. Для практики ж найбільше значення має область раціонального дизайну лікарських засобів та біологічно активних речовин, що специфічно взаємодіють з обраними мішенями і коригують роботу того чи іншого молекулярного шляху.

Рис, 4. Тривимірна модель капсида сателіта вірусу тютюнової мозаїки (STMV). Поверхня вірусу розфарбована залежно від значення електростатичного потенціалу. Фото: ks.uiuc.edu

Молекула — квантово-механічний об’єкт. Тому редукція її опису від багатоповерхових гамільтоніанів до простої геометрії (що відбувається при використанні поняття поверхні) — безсумнівне і навмисне спрощення. На аналогічних припущеннях, до речі, будується все молекулярне моделювання, що базується на концепції емпіричних силових полів ^{* *.}

З практичних міркувань коректна і непідйомна квантова механіка замінюється на ньютонівську фізику, просту, але тим не менш здатну досить адекватно описати динамічні властивості біополімерів (хоча і залишаючи «за бортом» хімічні перетворення або спектроскопічні ефекти). Однак молекулярна поверхня і сама по собі — складний об’єкт як чисто геометрично, так і з позицій обчислювальних алгоритмів: комп’ютерні файли з розрахованими поверхнями і значеннями різних фізико-хімічних параметрів дуже громіздки (особливо в разі великих біополімерів і при виборі високої щільності точок на поверхні). Іноді можна піти у спрощеннях ще далі. Якщо поверхню молекули або її частину без істотних втрат можна уявити у вигляді будь-якої простої геометричної форми — площини, циліндра або сфери, аналіз складного тривимірного об’єкта зведеться до (квазі) почесного випадку. Розгляньмо три приклади того, як розрахунки з молекулярними поверхнями дозволяють витягти з комп’ютерного моделювання осмислену біологічну інформацію.

Площина і вразливість бактеріальної мембрани

Мембрана — принципово важливий клітинний компонент, її будова досить консервативна і має свої відмінні риси для кожного з трьох доменів живих організмів. Так, бактеріальна мембрана відрізняється від еукаріотичної, загалом електронейтральної, негативним зарядом, а також наявністю особливої молекули з довгим гідрофобним ізопреноїдним «хвостом» і гідрофільною «головкою» пептидогликанової природи — ліпіда-II (рис. 5) [3]. Він служить човниковим переносником цього муреїнового фрагмента — життєво необхідного «будівельного блоку» бактеріальної стінки. Ця унікальна молекула зустрічається тільки в бактеріальній мембрані і, не будучи біополімером, послідовність якого легко мутує за участю генетичних механізмів, володіє консервативною хімічною структурою. Саме тому на ліпід-II спрямовані атаки безлічі природних антибіотиків, специфічно його розпізнають і мають бактеріостатичну або бактерицидну дію.

Рис, 5. Комп’ютерна модель «ахіллесової п’яти» бактеріальної мембрани — ліпіда-II. Сірим показано «хвости» ліпідів мембрани, червоно-помаранчевим — їхні «головки», зеленим — ліпід-II, синім — іони натрію в розчиннику (воді)

Рис. 6. Ліпід-II на карті молекулярного гідрофобного потенціалу (МГП) ділянки бактеріальної мембрани (а) і в комплексі з низином (б). На карті МГП гуртками зображені молекули фосфоліпідів, ламаною лінією, що з’єднує кольорові геометричні фігури, — ліпід-II. У присутності його гнучкої молекули виникає довгоживуча амфіфільна ділянка, що нагадує океанський атол: підковоподібна гідрофобна область і гідрофільна «лагуна» в центрі. У комплексі ліпіда-II і низина гідрофобна поверхня молекули антибіотика показана коричневим, гідрофільна — блакитним, а «скелет» — паличками всередині поверхні; фрагмент молекули ліпіда-II зображений зовні. Товсті палички позначають ті області, які, мабуть, відіграють вирішальну роль у взаємному розпізнаванні цих молекул. Структура, що виникає, коли низин «вчіпляється» в ліпід-II, — «пірофосфатна клітина». Видно, що просторові гідрофобні властивості антибіотика повторюють такі для «атола», що утворюється на бактеріальній мембрані навколо молекули ліпіда-II: в середині гідрофільна область, а по краях — гідрофобна. Така відповідність пояснює, як низину вдається виявити настільки рідкісну молекулу ліпіда-II на мембрані

Коли встановили просторову структуру комплексу ліпіда-II з одним із впізнаючих його антибіотиків — низином [4], виявилося, що головний структурний фрагмент, який «видає» ліпід-II і робить його «ахіллесовою п’ятою» бактеріальної мембрани, — пірофосфат, хімічне угруповання, яке не зустрічається в навколишніх ліпідах. Однак пояснити чітке розпізнавання цим антибіотиком ліпіда-II дуже непросто: на досить великій (порівняно з розміром ліпіда) поверхні бактеріальної мембрани розташоване дуже мало (близько 2000) молекул ліпіда-II, а діючі концентрації низину вкрай низькі. Як у цих умовах відбувається первинне зібрання антибіотика і його «жертви»?

В результаті комп’ютерного аналізу поверхні бактеріальної мембрани в околицях ліпіда-II ми з’ясували, що останній, в силу гнучкості свого довгого «хвоста», вносить істотні зміни в структуру оточуючих його фосфоліпідів і в розподіл гідрофобних властивостей на мембрані [5]. Для її фрагмента ми провели розрахунок методом молекулярної динаміки, а в якості контролю прийняли рівний за розміром фрагмент мембрани еукаріот. На проекційних «картах», що зображують динамічний розподіл гідрофобності, ліпід-II опинився в центрі гідрофобного «атола» досить великого розміру і характерного часу життя (рис. 6). Мабуть, існування цієї амфіфільної ділянки, відсутньої в мембрані еукаріот навіть при розрахунку з ліпідом-II, — унікальна особливість, що привноситься на поверхню мембрани бактерій довгою і гнучкою молекулою ліпіда-II. Зроблені розрахунки дозволяють припустити, що розпізнавання антибіотиком своєї мішені відбувається в два етапи. Другий, більш специфічний, — захоплення пірофосфатної групи ліпіда-II в «клітку» водневих зв’язків, утворюваних макроциклами в структурі низину (див. рис. 6, б). У знаходженні ним амфіфільної області, яка «видає» ліпід-II, що ховається в мембрані, можливо, полягає перша стадія. Облік цього гіпотетичного механізму допоможе створити нове покоління мембранних антибіотиків, безпечних для людини і вільних від тягаря резистентності, що навис над більшістю класичних аналогів.

Циліндр і димеризація трансмембранних доменів

Рис, 7. Схема будови та димеризації рецепторних тирозінкіназ (малюнок О.О. Полянського). Рецепторний, трансмембранний (ТМ) і кіназний домени показані фіолетовим, бежевим і зеленим кольорами, відповідно; пунктирна червона лінія розділяє мономери; синім зображено область димеризації

Рецепторні тирозинкінази (РТК) — важливі молекули, що беруть участь в регуляції клітинного циклу і ділення. Вони сприймають численні фактори росту, цитокіни і гормони (у тому числі інсулін і гормон росту). У геномі людини закодовано 58 таких рецепторів, що підрозділюються на 20 сімейств. Порушення роботи багатьох з цих білків призводить до розвитку онкологічних захворювань, тому її вивчення — не тільки фундаментальне, а й медичне завдання. Ці рецептори складаються з трьох доменів. Два з них великі — позаклітинний, розпізнаючий ліганди, і внутрішньоклітинний, в якому здійснюється фосфорилювання і який передає сигнал на різні біохімічні каскади. З’єднуючий їх трансмембранний домен, що пронизує мембрану клітини, складається з єдиної лід-спіралі. Механізм активації рецепторних тирозінкіназ при пов’язуванні ліганда (наприклад, фактора зростання фібробластів) полягає в димеризації двох молекул рецептора саме в цьому домені (рис. 7).

В останні роки в експериментальному визначенні просторової структури таких дімерів було досягнуто значного прогресу [6]. Однак методи комп’ютерного моделювання також відіграють істотну роль у вирішенні цієї біологічної задачі. У ряді випадків вони дозволяють вирішити проблему передбачення структури дімера з меншими витратами, а головне, запропонувати відразу кілька ймовірних варіантів упаковки (тобто створити ансамбль можливих конформацій), кожен з яких може реалізуватися за певних умов. У нашій лабораторії підійшли до вирішення цього завдання не «в лоб» (помістивши два трансмембранних фрагмента рецептора в мембрану і запустивши тривалий розрахунок методом молекулярної динаміки), а взявши до уваги багато в чому геометричну суть завдання — встановити можливий мотив схрещування двох приблизно циліндричних тел. При цьому крім просторової комплементарності трансмембранних спіралів враховувалася і відповідність їх фізико-властивостей. Всі обчислення виробляли на рівні циліндричних карт-розгорток, порівнювати які набагато простіше, ніж тривимірні тіла складної форми (рис. 8) [7]. Відповідний алгоритм був реалізований на веб-сервері PREDDIMER [8], який дозволяє реконструювати набір дімерних структур для заданих трансмембранних послідовностей, а також візуалізувати отримані конформації у вигляді 3D-моделей і 2D-карт поверхневої гідрофобності лід-спіралей з зазначеною областю димеризації. Тестування сервера на 11 трансмембранних послідовностях, для яких раніше методом ЯМР-спектроскопії були отримані 3D-конформації, показало, що алгоритм робить передбачення з досить високою точністю. Розуміння механізму димеризації рецепторних тирозінкіназ дозволить за допомогою комп’ютерного дизайну створити речовини, що коригують її порушення і виправляють підвищену активність цих рецепторів, яка часто призводить до ракового переродження клітин.

Рис, 8. Передбачення механізму димеризації трансмембранних доменів рецепторних тирозінкіназ (малюнок О.О. Полянського). Схема роботи алгоритму PREDDIMER на прикладі сегмента ефринового рецептора (EphA), який бере участь в ембріогенезі. Спочатку конструюється ідеальна лід-спіраль на основі амінокислотної послідовності трансмембранного домену (а). Потім проводиться розрахунок гідрофобних/гідрофільних властивостей на молекулярній поверхні (МГП — молекулярний гідрофобний потенціал), які зображені коричневим і синім (б). Далі будуються почесні циліндричні карти-розгортки (z — координата вздовж осі циліндра) поверхні, що показують одночасно гідрофобність і «рельєф» (в). Нарешті, шукається оптимальне суміщення двох карт з найкращою відповідністю поверхонь (г) і реконструюється структура спірального дімера (д)

Сфера і отрута скорпіонів

У природних отрутах часто містяться нейротоксини, мішень яких — іонні канали і рецептори в мембранах клітин нервової системи або м’язів. Вивчення цих молекул допомагає зрозуміти роботу нейрорецепторів і навчитися її регулювати, що важливо як для фундаментальних завдань, так і для медичних додатків, що полягають у корекції порушень роботи нервової системи. Наприклад, у отруті скорпіонів виявлено так звані лід-нейротоксини, що специфічно впливають на іонні канали комах або ссавців: перші можна назвати інсекто-, а другі — ссавцями. У чому причина їх специфічної дії? Детально вивчивши атомну будову і властивості молекул двох груп лід-токсинів, ми повинні були знайти значущі структурні відмінності, що визначають селективність цих речовин. Порівняючи структури інсекто- і ссавців, ми дійсно виявили помітні відмінності між ними. Для цього було створено алгоритм «білкової топографії» [9], назва якого відображає його виразну схожість з картуванням земної поверхні, оскільки форма нейропептидів була практично ідеально наближена до сфери (рис. 9, а). Використовуючи метод молекулярної динаміки, розрахунок поверхні з розподілом на ній гідрофобних властивостей і побудова сферичних проекцій, ми шукали на почесних картах токсинів загальні закономірності і специфічні ділянки, а потім зіставляли ці дані з відомими активністю і вибірковістю дії таких білків. Ми виявили в досліджених молекулах функціональні «модулі», які відрізняються за своїми властивостями і, імовірно, відповідають за специфічну дію інсекто- і ссавців (рис. 9, б). Щоб перевірити цю гіпотезу, ми синтезували токсин із заздалегідь невідомою специфічністю, на підставі наших розрахунків передбачили його вибірковість (комахи або ссавці) і потім експериментально виміряли його біологічну активність. Результат повністю підтвердив зроблене передбачення [10]. Алгоритм білкової топографії, заснований на роботі з молекулярними поверхнями і розрахунках молекулярної динаміки, допоможе в пошуку структурно-функціональних залежностей в біоактивних пептидах і невеликих білках. Біоінженерний підхід, що вимагає знання цих залежностей, можна застосовувати до створення специфічних аналогів природних нейропептидів і нейромодуляторів. А це відкриє нові перспективи для медицини та сільського господарства.

Рис. 9. Структурні відмінності ссавців та інсектотоксинів, що визначають специфічність їх дії. Карта-розгортка, отримана методом білкової топографії, який заснований на картуванні властивостей, розподілених на поверхні сфери (а). В результаті на карті можна «розгледіти» молекулу цілком з усіх боків. Карти гідрофобних/гідрофільних властивостей (МГП — молекулярний гідрофобний потенціал) для ссавців та інсектотоксинів (б). Найбільша відмінність двох карт спостерігається в районі модуля специфічності, окресленого червоним контуром. Сині точки відповідають проекціям амінокислотних залишків, серед останніх зеленим виділені ті, які характеризуються підвищеною еволюційною варіабельністю

Отже, порівняно нескладні маніпуляції з молекулярними поверхнями дозволяють витягувати з комп’ютерних розрахунків біополімерів по-справжньому унікальну інформацію. Крім наг