Працюючі мутанти

Ці живі істоти вже ніколи не зможуть жити на волі. Їх геном багаторазово перекроєний заради лише одного завдання — невтомно працювати на людину. Мільйони цих біороботів виробляють у величезних кількостях те, що самим їм практично не потрібно. Вони пручаються, вони хотіли б жити по-іншому, але хто ж їм це дозволить?

За ввідним пасажем, написаним у стилі антиутопії, насправді стоїть буденна реальність. Йдеться про мікроорганізми, спеціально адаптовані для роботи в біотехнологічному виробництві. Взагалі-то мікроорганізми — бактерії та гриби — «вколюють» на людство з незапам’ятних часів, причому до відкриттів Луї Пастера люди навіть не здогадувалися, що, замішуючи дріжджове тісто, сквашуючи молоко, виготовляючи вино або пиво, вони мали справу з роботою живих істот.

У пошуках супердіяльностей

Але хоч би як було, інтуїтивно, методом стихійної селекції за тисячоліття людям вдалося відібрати з природних, «диких» форм мікроорганізмів високоякісні культури для виноробства, сироваріння, хлібопечення. Інша річ, що вже в новітню епоху працюючим бактеріям були знайдені нові застосування. Виникли великотоннажні біотехнологічні підприємства з виробництва, наприклад, таких важливих хімічних продуктів, як амінокислоти або органічні кислоти.

Суть біотехнологічного виробництва в тому, що мікроорганізми, поглинаючи вихідну сировину, наприклад цукор, виділяють якийсь метаболіт, продукт обміну речовин. Цей метаболіт і є кінцевим продуктом. Проблема лише в тому, що в клітці присутні кілька тисяч метаболітів, а виробництву потрібен якийсь один, зате в дуже великих кількостях — наприклад, 100 г/л (при тому, що в природних умовах метаболіт вироблявся б в кількостях, на два-три порядку менших). Ну і зрозуміло, бактерії повинні працювати дуже швидко — видавати потрібний обсяг продукту, скажімо, за дві доби. Такі показники диким формам вже не під силу — для цієї «потогонної» системи потрібні супермутанти, організми з десятками різних модифікацій геному.

Ближче до природи

Тут варто задатися питанням: а навіщо взагалі залучати біотехнології — хіба хімічна промисловість не справляється з виробництвом тих же амінокислот? Справляється. Хімія в наші дні може багато чого, однак у біотехнологій є кілька серйозних переваг. По-перше, вони оперують відновлюваними ресурсами. Зараз в якості сировини в основному використовуються крохмало- і цукровмісні рослини (пшениця, кукурудза, цукровий буряк). У майбутньому, як вважається, буде активно застосовуватися целюлоза (деревина, солома, макуха). Хімічна галузь працює переважно з викопними вуглеводнями.

По-друге, в основі біотехнологій лежать ферменти живих клітин, які працюють при атмосферному тиску, нормальній температурі, у водних неагресивних середовищах. Хімічний синтез протікає, як правило, при величезному тиску, високих температурах, з використанням їдких, а також вибухо- і пожежонебезпечних речовин.

По-третє, сучасна хімія побудована на застосуванні каталітичних процесів, а в ролі каталізаторів, як правило, виступають метали.

Метали не відносяться до відновлюваної сировини, а застосування їх ризиковано з точки зору екології. У біотехнології функцію каталізаторів виконують самі клітини, і при необхідності клітини легко утилізувати: вони розкладаються на воду, вуглекислий газ і невелику кількість сірки.

І нарешті, четверта перевага укладена у властивостях одержуваного продукту. Наприклад, амінокислоти є стереоізомерами, тобто молекули мають дві форми, що володіють однаковою структурою, але просторово організовані як дзеркальні відображення один одного. Оскільки L- і D- форми амінокислот по-різному ламають світло, такі форми називають оптичними.

З точки зору біології, між формами є істотна відмінність: тільки L-форми є біологічно активними, тільки L-форма використовується клітиною як будівельний матеріал для білка. При хімічному синтезі виходить суміш ізомерів, витяг з неї правильних форм — окремий виробничий процес. Мікроорганізм, як біологічна структура, продукує речовини тільки однієї оптичної форми (у разі амінокислот — тільки в L-формі), що робить продукт ідеальною сировиною для фармацевтики.

Хімія проти біотехнології

Битва з кліткою

Отже, завдання підвищення продуктивності для біотехнологічних виробництв природними штаммами вирішити не можна. Необхідно використовувати методи генної інженерії, щоб фактично змінити стиль життя клітини. Всі її сили, вся її енергія, і все, що вона споживає, має бути спрямоване на мізерний ріст і (в основному) на виробництво у великих кількостях потрібного метаболіту, будь то амінокислота, органічні кислоти або антибіотик.

Яким чином створюються бактерії-мутанти? У недавні часи це виглядало так: брали дикий штам, потім проводили мутагенез (тобто обробку спеціальними речовинами, які підвищують кількість мутацій). Оброблені клітини розсівали, отримували тисячі окремих клонів. І були десятки людей, які перевіряли ці клони і шукали ті мутації, які найбільш ефективні в якості продуцентів.

Найбільш перспективні клони відбирали, і наступала черга наступної хвилі мутагенезу, і знову розсіювання, і знову відбір. По суті, все це мало чим відрізнялося від звичайної селекції, давно використовуваної в тваринництві і рослинництві, якщо не вважати застосування мутагенезу. Так десятиліттями вчені відбирали кращих з численних поколінь мікроорганізмів-мутантів.

Сьогодні використовується інший підхід. Все тепер починається з аналізу шляхів метаболізму і виявлення основного шляху конверсії цукрів до цільового продукту (а шлях цей може складатися з півтора десятка проміжних реакцій). Адже в клітці, як правило, присутні багато побічних шляхів, коли вихідна сировина йде на якісь зовсім не потрібні виробництву метаболіти. І для початку всі ці шляхи потрібно відсікти, щоб конверсія прямувала безпосередньо на цільовий продукт. Як це зробити? Змінити геном мікроорганізму.

Для цього використовуються спеціальні ферменти і невеликі фрагменти ДНК — «праймери». За допомогою так званої поліциклічної реакції в пробірці можна витягнути з клітини окремий ген, скопіювати його у великій кількості і піддати його зміні.

Наступне завдання — повернути ген у клітку. Вже змінений ген вставляють у «вектори» — це невеликі кільцеві молекули ДНК. Вони здатні переносити змінений ген з пробірки знову в клітку, де він заміщує колишній, нативний ген. Таким чином можна ввести або мутацію, яка повністю порушує функцію непотрібного виробництва гена, або мутацію, яка змінює його функцію.

У клітці існує дуже складна система, що перешкоджає виробництву в надлишковій кількості будь-якого метаболіту, того ж лізину наприклад. Природним шляхом він виробляється в кількості приблизно 100 мг/л. Якщо його виявляється більше, то сам лізин починає інгібувати (уповільнювати) початкові реакції, що ведуть до його виробництва. Виникає негативний зворотний зв’язок, виключити який можна лише за допомогою введення в клітку чергової генної мутації.

Однак розчистити шлях сировини до кінцевого продукту і зняти вбудовані в геном заборони на зайве виробництво необхідного метаболіту — це ще не все. Оскільки, як вже говорилося, формування потрібного продукту проходить всередині клітини певну кількість стадій, на кожній з них може виникнути «ефект пляшкового горлечка». Наприклад, на одній із стадій фермент працює швидко і проміжного продукту виробляється багато, а на наступній стадії пропускна здатність падає і незатребуваний надлишок продукту загрожує життєдіяльності клітини. Значить, необхідно посилити роботу гена, який відповідає за повільну стадію.

Посилити роботу гена можна, підвищивши його копійність — іншими словами, вставивши в геном не одну, а дві, три або десять копій гена. Інший підхід — «підшити» до гену сильний «промотер», або ділянка ДНК, що відповідає за експресію конкретного гена. Але «розшивання» одного «пляшкового горлечка» зовсім не означає, що воно не виникне на наступній стадії. Тим більше що факторів, що впливають на перебіг кожної стадії отримання продукту, дуже багато — необхідно враховувати їх вплив і вносити корективи в генну інформацію.

Таким чином «змагання» з кліткою може тривати довгі роки. На вдосконалення біотехнології виробництва лізину пішло приблизно 40 років, і за цей час штам «навчили» виробляти за 50 годин 200 г лізину на літр (для порівняння: чотири десятиліття тому цей показник дорівнював 18 г/л). Але клітина продовжує чинити опір, адже такий режим життєдіяльності для мікроорганізму вкрай важкий. Працювати у виробництві вона явно не хоче.

І тому, якщо регулярно не стежити за якістю клітинних культур, в них неминуче виникнуть мутації, що знижують продуктивність, які будуть охоче підхоплені відбором. Все це говорить про те, що біотехнологія — це не така річ, яку можна розробити одноразово, а потім вона буде діяти сама. І необхідність підвищувати економічну ефективність і конкурентоспроможність біотехнологічних виробництв, і запобігання деградації створених високопродуктивних штамів — все вимагає постійної роботи, в тому числі фундаментальних досліджень в області функцій генів і клітинних процесів.

Залишається одне питання: а чи не є організми-мутанти небезпечними для людини? Що якщо вони потраплять з біореакторів в навколишнє середовище? На щастя, небезпеки ніякої немає. Ці клітини збиткові, вони абсолютно не пристосовані до життя в природних умовах і неминуче загинуть. У мутантній клітині все так змінили, що вона може рости лише в штучних умовах, в певному середовищі, при певному типі харчування. Зворотного шляху в дикий стан для цих живих істот вже немає.