Приони та амілоїди: ключові властивості і роль у природі

Майже всі інфекційні агенти, будь то віруси, бактерії або найпростіші, мають геном у вигляді ДНК або РНК, що визначає життєвий цикл і «план захоплення» організму-господаря. Дивним винятком з цього правила є приони — інфекційні агенти білкової природи, які не мають якогось геному. Найбільш відомі з прионних захворювань — хвороба Крейцфельдта — Якоба, синдром Герстманна — Штраусслера — Шейнкера, хвороба канібалів куру («сміється смерть»), а також бичача губчаста енцефалопатія («коров’ячий сказ») і скрейпі («почесуха») овець. Усі ці захворювання мають нейродегенеративний характер, невиліковні і призводять до смерті *.

Перші згадки скрейпі відносяться до XVIII ст., але причина прионних хвороб була встановлена лише в 1982 р., коли американський дослідник Стенлі Прузінер (S. B. Prusiner) ^* * виділив інфекційний білок і запропонував термін «прион» (англ. prion — анаграма зі слів protein і infection). Прузинер встановив, що прион являє собою структурно змінену форму білка, в нормі присутнього в клітинах організму-господаря [1]. Виявлений білок був позначений PrP (англ. prion protein), а його патологічна форма P^rPSc (Sc від англ. scrapie — скрейпі). Інфекційність P^rPSc пов’язана з тим, що він здатний, взаємодіючи з нормальним білком PrP, викликати в ньому структурну перебудову і перетворювати його на подобу себе. P^rPSc не схильний до деградації, він накопичується в організмі, в першу чергу в мозку, порушуючи функцію і викликаючи загибель нейронів. Оскільки PrP є власним білком організму, прионні хвороби не викликають імунної відповіді. Роботу з прионами ускладнює і те, що вони стійкі до кип’ятіння та обробки формаліном.

Приони дріжджів

Усі прионні хвороби ссавців пов «язані з перетворенням єдиного білка — PrP [1]. Приони були також виявлені у нижчих еукаріот, причому в значно більшій кількості. Зараз прионні властивості виявлені у дев’яти білків дріжджів Saccharomyces cerevisiae і в одного білка міцеліального гриба Podospora anserina. Правда, слід зазначити, що ці приони проявляють себе не як інфекційні агенти, а як генетичні елементи з нестандартними властивостями. Дріжджі та гриби мають досить міцну клітинну стінку, що запобігає проникненню будь-якої інфекції, і тому приони можуть передаватися лише від батьків до нащадків, а також при схрещуванні. Приони нижчих еукаріот у більшості випадків не тільки не становлять істотної шкоди для клітин господаря, але й можуть бути навіть корисні.

У дріжджів найкраще вивчений так званий детермінант [PSI +], відповідний прионній формі білка Sup35, відомого також як фактор термінації трансляції eRF3. Цей білок необхідний для завершення синтезу білків (трансляції), яке відбувається на кодонах, що не діють (нонсенс). У результаті мутацій всередині кодуючої області генів можуть виникати передчасні нонсенс-кодони, що переривають синтез білка. [PS^I +] знижує активність Sup35, що дозволяє прочитувати повністю такі гени, не перериваючись на передчасних нонсенс-кодонах. [P^SI +] став популярною моделлю, що дала дуже багато для розуміння загальних властивостей прионів.

Детермінант [PSI +] був виявлений ще в 1965 р. Брайаном Коксом (B. S. Cox) [2]. Але пояснити природу цього білка вдалося лише в 1994 р. Риду Вікнеру (R. B. Wickner), який припустив, що [PS^I +] відображає перехід білка Sup35 в неактивну прионну форму [3]. Ця гіпотеза незабаром підтвердилася. Ми і одночасно співробітники лабораторії Сьюзан Ліндквіст (S. Lindquist) з’ясували, що в клітинах, що містять [P^SI +], білок Sup35 переходить в агрегований стан [4, 5], і ці агрегати мають характерну властивість пріонів — здатні переводити неагрегований білок Sup35 з неприонних клітин [^PSI ‑] в агреговану форму [6].

Мономер чи полімер?

Відомі дві моделі прионного перетворення, які покладаються на різні уявлення про природу цієї форми білків. Перша модель [7] прийшла разом з прионною концепцією для PrP, яка допомогла зв’язати загадкові детермінанти дріжджів з прионним явищем. Відповідно до цієї моделі, відомої як «гетєродимірна», прионна форма білка являє собою мономер зі зміненою структурою, а перетворення білка відбувається в результаті взаємодії прионної і неприонної молекул, після чого дві прионні молекули відокремлюються один від одного.

Альтернативна модель передбачає, що прион — це різновид амілоїду, тобто нековалентно-зв’язаний білковий полімер. Амілоїдами називають фібрилярні білкові агрегати з регулярною структурою, визнані причиною понад 30 невиліковних вікових захворювань, таких, як хвороби Альцгеймера і Паркінсона [8]. Амілоїди подібні до прионів за двома ключовими властивостями. По-перше, укладання білка в складі амілоїду істотно змінена і утворює характерну структуру, звану крос-бета, в якій поліпептидні ланцюги перпендикулярни осі фібрили, а утворювані ними бета-шари паралельні осі. По-друге, амілоїд каталізує структурне перетворення і полімерізацію нормальної мономерної форми відповідного білка.

Нам стало ясно, що вірна саме друга модель. Гетєродимірна модель має суттєві слабкості. Вона передбачає досить неправдоподібні властивості білка PrP. Наявність у білка двох альтернативних укладок сама по собі незвичайна, але ще важче уявити, що одна з цих укладок здатна перетворювати іншу в собі подібну. Крім того, відомо, що існують штами приона з різними властивостями, а, значить, альтернативних самовідтворюваних укладок має бути безліч — і це вже абсолютно неподається. Не менш важко пояснити і поділ двох прионних молекул після перетворення однієї з них, за умови, що процес не витрачає енергію у вигляді АТФ або ГТФ. У полімерній же моделі таких проблем немає: наявність різних самовідтворюваних укладок у складі полімеру добре відома, а поділ молекул під час полімеризації не потрібен.

Слід зауважити, що під формальне визначення приону потрапляє як мінімум одне явище, не пов’язане з амілоїдами. Так, дріжджовий прион [b] являє собою вакуолярну протеазу В, яка синтезується неактивною і активується за рахунок видалення аміноконцевого пептида іншої, активної, молекулою протеази В. Потім наша молекула може активувати інші молекули протеази В, видаляючи пептид, що, до речі, нагадує гетєродимірну модель [9].

Структура і розмноження прионів

На підтримку полімерної моделі для білка Sup35 Джон Гловер (J. R. Glover) і Сьюзан Ліндквіст показали, що in vitro білок Sup35 утворює амілоїдні фібрили [10]. Для цього, як і для підтримки прионного стану, необхідний тільки невеликий аміноконцевий домен Sup35. Аналогічні результати були отримані і для іншого прионного білка дріжджів, Ure2. Надалі з’ясувалося, що прионогений аміноконцевий домен утворює стрижень амілоїда, до якого прикріплені інші домени білка, які, ймовірно, зберегли свою вихідну структуру (рис. 1). Схожу будову мають усі приони дріжджів.

Ріс. 1. Фібрілли, утворені білком Sup35 (а) [10] і схематична структура цих фібрил і прионних частинок Sup35 (б). Білок Sup35 складається з трьох доменів: аміноконцевий (N) необхідний для прионного перетворення і утворює стебель амілоїда; карбоксиконцевий (С) виконує життєво важливу функцію в термінації трансляції, а середній домен (М) грає роль спейсера, що з’єднує ці два домени

Звернемо увагу, що in vitro Sup35, як і інші подібні білки, самодостатній для амілоїдного перетворення. Однак у клітинах дріжджів підтримка приона в ряду поколінь вимагає дії специфічного шаперона (англ. chaperone — «супроводжувати»; білки, що забезпечують правильне згортання поліпептидних ланцюгів білків) — Hsp104 [11]. Цей білок займає особливе місце серед шаперонів: він витягує білкові молекули з агрегатів, що утворюються в результаті теплового шоку. Парадоксальним чином до втрати [PSI +] призводить не тільки відсутність Hsp104, а й у багатьох випадках його надлишок.

Ми запропонували гіпотезу, яка описує розмноження прионів дріжджів і одночасно дозволяє парадокс Hsp104 [12]. Ми виходили з припущень, що прионні частинки Sup35 являють собою амілоїдні фібрили, а шаперон Hsp104 розпізнає їх, як агрегати неправильно згорнутого білка, і витягує з них молекули Sup35 (рис. 2). Вилучення кожної молекули з фібрили має розбивати її на дві частини (за умови, що дія Hsp104 відбувається не на краю фібрили). При цьому подвоюється кількість кінців фібрил, які каталізують прионне перетворення, що прискорює перехід білка в прионний стан. Таким чином, при дії Hsp104 фактично відбувається подвоєння приона, незважаючи на те, що кількість агрегованого Sup35 не зростає. За відсутності Hsp104 розмноження приона не відбувається (хоча прионне перетворення триває), і він порівняно швидко губиться зі зростаючої популяції дріжджів.

Рис, 2. Цикл розмноження приону дріжджів. Прионні частинки Sup35 ростуть, приєднуючи до себе нові молекули Sup35. Шаперон Hsp104 (гексамерна частинка з каналом у центрі, показано її поздовжній переріз) випадково висмикує молекули Sup35 з прионної частинки (полімеру), простягаючи їх через канал у вигляді розгорнутих поліпептидних ланцюгів. В результаті прионна частинка розпадається на дві частини

Цікаво зазначити, що дія Hsp104, необхідна для розмноження прионів, спрямована на розчинення білкових агрегатів і знищення приона. Якщо активність Hsp104 збільшити, то можна домогтися того, що розчинення прионних частинок буде відбуватися швидше, ніж їх зростання, і тоді прион буде втрачений. І це дійсно можна спостерігати при надпродукції Hsp104 для багатьох варіантів [PSI +].

Надалі полімерна модель отримала переконливі експериментальні підтвердження. З’ясувалося, що в [PSI +] клітинах дріжджів більшість Sup35 є амілоїдними полімерами, а не мономерами. Правда, ці полімери багаторазово коротші за спостережувані in vitro, що, мабуть, говорить про їх фрагментацію. Їх розмір становить від 10 до 50 мономерів. Це означає, що їх довжина лише ненабагато перевищує їх товщину (ауд 10 нм). З’ясувалося також, що фрагментуюча активність залежить від Hsp104 [13].

Фрагментуючу активність Hsp104 можна інгібувати додаванням в середу гідрохлориду гуанідіну (ГуГХ), і на цьому заснований досить наочний тест з визначення кількості прионних частинок в клітці. Одну клітку, що містить [PSI +], вирощують у присутності ГуГХ до утворення маленької колонії. Прионні частинки при цьому не множаться, хоч і ростуть, і в ході клітинних поділів вони випадково розподіляються по окремих клітинах, які потім можна перерахувати. Цю колонію розсівають окремими клітинами на чашку Петрі з низьким вмістом аденіну в поживному середовищі, де клітини, що зберегли прионні частинки, дають великі білі [PS^I +] колонії, а клітини без приона — дрібні червоні [P^SI ‑] колонії. Кількість білих колоній дорівнює числу прионних частинок у вихідній клітині. Виявилося, що [^PSI +] клітини містять залежно від варіанту [PSI +] від 100 до 1000 прионних частинок [14].

Для доказу прионної концепції була розроблена процедура трансформації клітин дріжджів амілоїдними фібриллами. З’ясувалося, що амілоїди Sup35, отримані in vitro з білка, продукованого бактерією Escherichia coli, потрапляючи в дріжджову клітку, переводять Sup35 в прионний стан. Крім того, при різній температурі in vitro утворюються фібрили Sup35 з різною структурою. Виявилося, що під час потрапляння в дріжджі ці фібрили породжують фенотипічно різні варіанти [PSI +] [15]. Це говорить про залежність фенотипу приона від структури фібрил.

На даний момент цей результат можна вважати найбільш переконливим доказом прионної концепції. Таким чином, було підтверджено, що:

• дріжджові приони точно відповідають визначенню, будучи білковим інфекційним агентом; вони не пов’язані з якоюсь нуклеїновою кислотою (ПК), оскільки препарат фібрил, утворених in vitro, був очищений від ПК, і в ньому не могло бути ПК, специфічною для дріжджів;
• за структурою прион подібний амілоїду;
• варіанти приона визначаються різним укладанням білка у складі полімеру.

Таким чином, дріжджові приони являють собою амілоїдні фібрили, дрібно нарізані за допомогою Hsp104.

Прионні варіанти

Прион [PSI +], як і приони ссавців, може існувати у багатьох варіантах. Зазвичай їх розрізняють за ефективністю супресії нонсенс-мутацій і стабільності спадкування. Ці параметри корелюють і визначаються з невисокою точністю, що не дозволяє розрізнити з їх допомогою велику кількість варіантів. Тому загальна кількість можливих варіантів неясна, їх можуть бути як одиниці, так і сотні.

На практиці варіанти [PSI +] грубо ділять на два класи — сильні і слабкі. Для перших характерна висока ефективність супресії нонсенс мутацій і висока стабільність спадкування, у других ці параметри знижені. З результатів біохімічного аналізу випливає, що клітини з сильним [PS^I +] містять менше мономерного Sup35 порівняно зі слабким [P^SI +], а прионні полімери Sup35 більш короткі. Це дозволяє зрозуміти порівняльну динаміку прионної полімеризації у варіантів [^PSI +]. Менший розмір прионних частинок означає їх більше число і більш ефективну полімерізацію, що призводить до меншої кількості мономерного Sup35 і більш ефективної супресії. Збільшена кількість прионних частинок також забезпечує більш високу стабільність спадкування. Загалом «сила» [PSI +] зростає зі збільшенням частоти фрагментації прионних частинок [13].

Примітно, що деяким структурно можливим варіантам амілоїда Sup35 відповідають параметри [PSI +], несумісні або з життям клітини, або з спадкуванням приона. Так, у деяких варіантах [PS^I +] залишається занадто мало мономерного Sup35, що порушує життєздатність клітини [16]. На протилежному кінці спектра варіантів [P^SI +] містяться неосліджені амілоїди Sup35, виявлені нами. Вони утворюються при надпродукції Sup35 в клітинах, що містять прион [^PIN +]. Цей прион, заснований на білці Rnq1, відомий тим, що він полегшує виникнення ^[PSI +], мабуть, служачи недосконалою затравкою для полімеризації Sup35. При стандартному рівні Sup35 в клітинах [PIN +] його полімерів дуже мало, однак при надпродукції Sup35 (приблизно в 20 разів) його частка в полімерній фракції зростає до 80%. Ці полімери, однак, нездатні до самостійного спадкування, і існують лише завдяки їх частому виникненню на основі прионних частинок Rnq1. Такі полімери Sup35 мають дуже великий розмір, що говорить про їх дуже рідкісну фрагментацію [17]. Таким чином, існуючі in vivo амілоїди Sup35 можна ранжувати за частотою фрагментації: від часто фрагментованих ^{сильних} [PSI +] до надто рідко фрагментованих ненаслідованих.

Можна вважати, що рідкісна фрагментація може не тільки бути причиною ненаслідованості амілоїдів в дріжджах, але і пояснювати неінфекційність амілоїдних хвороб людини в порівнянні з прионами. Інфекційність амілоїдів повинна зростати зі зменшенням їх розміру, оскільки при цьому більше амілоїдних частинок на одиницю маси і вище їх здатність до переміщення. Прионні частинки PrP^Sc мають порівняно малий розмір. Наприклад, під час хвороби Крейцфельдта — Якоба прионні відкладення (бляшки) часто з’являються пізніше, ніж перші симптоми захворювання, або не утворюються зовсім, що вказує на малий розмір приона. А інтенсивне формування бляшок при амілоїдних хворобах свідчить про великий розмір і малу мобільність амілоїдних частинок, що зменшує інфекційність. Межа між прионами і амілоїдами тонка: відомо, що деякі амілоїдні хвороби мають слабку інфекційність, яку можна виявити у модельних тварин за умов, що сприяють амілоідогенезу. Такими умовами можуть бути підвищена продукція амілоїдогенного білка, або введення амілоїдів не через харчовий тракт, а внутрішньоцеребрально.

Механізм фрагментації прионів дріжджів

Ключову роль у фрагментації прионних амілоїдів у дріжджах відіграє Hsp104, але за суттєвого сприяння інших шаперонів. Нагадаємо, що білки цього класу забезпечують і контролюють правильне просторове укладання інших білків. Фрагментація починається з того, що шаперон Sis1 сімейства Hsp40 розпізнає в прионній частинці якісь елементи неправильно укладеної білкової структури. Інші дріжджові Hsp40, зокрема, найбільш високо експресований Ydj1, мабуть, не беруть участі у фрагментації. Згідно з наявними даними, прионний домен упакований в амілоїдну структуру не повністю, і якась його частина залишається неструктурованою. При цьому у сильних варіантів [PSI +] розмір недозволеної області більший, ніж у слабких. Ймовірно, цю область і розпізнає Sis1, а потім, за участю шаперона Ssa (сімейства Hsp70), передає її Hsp104 — великому білку масою понад 100 кДа, що містить два АТФ-розщеплюючих блоки. Його робоча форма представляє кільце з шести молекул. Hsp104 чіпляє поліпептидний ланцюг прионного білка і простягає його крізь дірку в кільці, таким чином розплітаючи цей білок і витягуючи його з полімеру, який в результаті розпадається на дві частини (рис. 2).

Частота фрагментації — ключовий фактор, що визначає число прионних частинок, ефективність прионного перетворення і вираженість прионного фенотипу. Але що визначає частоту фрагментації?

Було виявлено, що фібрили, що відповідають сильному варіанту [PSI +], значно менш міцні, ніж фібрили слабкого [PS^I +]. У згоді з цим картування області Sup35, що становить ядро (стебель) амілоїда за допомогою воднево-дейтерієвого обміну показало, що у «сильних» фібрил в ядро амілоїда, покладена менша частина прионного домену (амінокислотні залишки 1-37, повний домен складається з перших 123 залишків), ніж у «слабких» (залишки 1-70) [18]. Ці спостереження породили припущення, що частота фрагментації визначається міцністю амілоїду.

На противагу цьому, ми з’ясували, що частота фрагментації визначається в першу чергу здатністю шаперонів розпізнавати амілоїд як субстрат для фрагментації. Зокрема, «сильну» фібрилу Sup35 легше дізнатися, ніж «слабку», оскільки у неї більше неструктурований останок прионного домену, не покладений в ядро і приваблює шаперони [19]. Але як розпізнаваність залежить від послідовності прионного домену? Крім розміру неупорядкованої області, все залежить від її амінокислотного складу, але не вимагає будь-яких специфічних елементів послідовності, оскільки, як було встановлено, її випадкова перетасовка в прионному домені Sup35 не порушує його прионних властивостей [20]. Щоб вивчити вплив амінокислотного складу на фрагментацію, ми створили набір генів Sup35, в яких прионний домен був замінений на послідовності (QQQXQ) n, де Q — глутамін, а Х — будь-яка амінокислота, із загальною довжиною повторів від 70 до 100 залишків. Полімери на основі суто поліглутамінової послідовності фрагментуються досить рідко, що дозволяє спостерігати ефект додавання інших амінокислот. Наприклад, ароматичні амінокислоти тирозин, триптофан або фенілаланин викликали максимальний ефект, багаторазово підсилюючи фрагментацію, а аланін, серін, треонін, цистеїн і метіонін — середній. Аспарагін, гліцин, валін і ізолейцин не поліпшували фрагментації, а пролін і лейцин перешкоджали утворенню полімерів [19]. Таким чином, частота фрагментації залежить від розміру та амінокислотного складу неструктурованої області прионного домену, не упакованої в ядро амілоїду.

Поширеність і роль у природі

Виявлення прионів у дріжджів стимулювало подальший пошук і дозволило припустити, що ці білки поширені в природі і не завжди пов’язані з хворобою. Поки найбільші успіхи в пошуку прионів відносяться до дріжджів S. cerevisiae. Прионна природа білка Ure2 дріжджів була виявлена одночасно з Sup35 [3]. Відповідний прион, [URE3], пов’язаний з метаболізмом азоту і дозволяє використовувати його незручні джерела (уреідосукцинат) у присутності бажаних сполук (солей амонію). Аналіз первинної структури Sup35 і Ure2 виявив значущу схожість: обидва містили прионогений аміноконцевий домен, збагачений залишками глутаміну і аспарагіну (QN), а також функціональний домен. Потім було знайдено прион [PIN +], що підвищує частоту виникнення [PS^I +]. Відповідний білок, Rnq1, також багатий QN, хоча і не містить явного функціонального домену. Був проведений цілеспрямований аналіз QN-багатих білків, в результаті чого було виявлено ще кілька прионів [21]. Крім того, багато з QN-багатих білків виявилися здатні утворювати амілоїди при підвищеній активності, але не могли стабільно зберігати прионний стан при звичайній експресії. Нещодавно знайдено перший прион дріжджів, Mod5 [M^OD +], не збагачений залишками QN. Зауважимо, що, в протилежність дріжджам, білок PrP і більшість амілоїдних білків ссавців не відрізняються надлишком QN. Виняток становлять гентінгтін (агрегує в нейронах головного мозку) і ще кілька білків, що утворюють амілоїди при подовженні в них поліглутамінової ділянки.

Чи є приони нижчих еукаріот патогенними або ж виконують якусь корисну функцію? Лише один з них має явну функцію: прион [het-s] гриба P. anserina входить в систему вегетативної несумісності, що контролює далекоглядні схрещування гриба. Поєднання приона і певних алелей гена het-s запускає механізм загибелі клітин, що утворюються при схрещуванні. Фактично, прион випадковим чином ділить популяцію на дві частини. Одна з них консервативна, «строга» до схрещувань, що захищає її від вірусних епідемій, інша ж користується всіма благами генетичного обміну, але ризикує зустрітися з вірусом. А популяція загалом отримує переваги обох стратегій.

Переваги прионів дріжджів не настільки очевидні, хоча деякі з них дають потенційно корисні фенотипи. Так, [MOD +] підвищує стійкість до фунгіцидів групи азолів; [PS^I +] компенсує нонсенс-мутації, а [URE3] дозволяє засвоювати бідні джерела азоту. Але, крім того, кожен з пріонів прямо або побічно впливає на безліч різних функцій і фенотипічних характеристик. Зокрема, п’ять з дев’яти прионних білків дріжджів (Ure3, Swi1, Mot3, Cyc8 і Sfp1) беруть участь у регуляції транскрипції. Поява прионів в окремих клітинах популяції дріжджів випадкова, а їхні численні фенотипічні прояви непередбачувані. Але вони вносять фенотипічне розмаїття і дозволяють популяції знайти кращу відповідь на різні несприятливі умови (температуру, відсутність води та харчування), що часто виникають в природі. Примітно, що при нормалізації умов приони, на відміну від мутацій, можуть бути втрачені з порівняно високою частотою, і тоді клітини повернуться точно до вихідного фенотипу.

Непатогенні амілоїди виявлені не тільки у дріжджів. У E. coli знайдені амілоїдні фібрили, що утворюють матрикс навколо клітин. Ці позаклітинні структури, які називають curli, що складаються з білка CsgA, дозволяють бактеріям формувати біоплівки і колонізувати нові субтрати.

Аналогічні амілоїди виявлені і у деяких інших бактерій. Патогенність Xanthomonas (хвороботворні бактерії рослин, зокрема тютюну) опосередковується позаклітинними амілоїдами білків харпінів. Проникаючи в міжклітинний простір, їхні фібрили дестабілізують мембрани рослинних клітин і викликають їх загибель. Амілоїди часто використовуються для побудови захисної зовнішньої структури клітин, оскільки їх відрізняє висока жорсткість і здатність до самозбірки. Такі амілоїди спостерігали біля актинобактерій Streptomyces, у грибів Neurospora crassa і у дріжджів. Аміл