Прокаріотична система імунітету допоможе редагувати геном

Ріс. 1. Дозрівання crPHK у CRISPR-системі I типу. CRISPR-ділянка складається з однакових послідовностей довжиною приблизно 30 нуклеотидів (повторів), розділених різними послідовностями довжиною теж приблизно 30 нуклеотидів (спейсерами). CRISPR-ділянки зібрані в групи (касети); кількість CRISPR в касеті і кількість касет дуже різниться у різних видів бактерій і архей: у архей в одній касеті може бути аж 300-500 CRISPR. Повтори відрізняються у різних видів прокаріот; що стосується спейсерів, то їх набір взагалі унікальний для кожного штаму. CRISPR-касети сусідять з так званими Cas-генами, що вносять серйозний внесок у роботу CRISPR-системи (детальніше про них розказано у підписі до рис. 2). Після транскрипції CRISPR-касети один із Cas-білків, ендонуклеаза CasE, розрізає довгий незрілий РНК-попередник на короткі зрілі crPHK; у одержаних crPHK фланкуючі (крайні) ділянки однакові і походять з повторів, а середина унікальна і утворена спейсером. Зображення зі слайдів до лекції К. В. Северинова на Зимовій школі, зі змінами

Хоча прокаріоти — це одні з найбільш просто організованих істот на Землі (простіше влаштовані тільки віруси), їх пристрій вражає своєю витонченістю і досконалістю. Наприклад, нещодавно в науковому світі буквально здійснило переворот відкриття прокаріотичних CRISPR-систем, які забезпечують придбаний імунітет до вірусів і плазмідів. Про роботу цих систем і про те, що їх вивчення може дати людству, розповів у своїй лекції на що проходить за підтримки РВК, Фонду «Династія» і РФФІ Зимовій школі FutureBiotech доктор біологічних наук Костянтин Вікторович Северинов.

Загадкові ділянки генома

Наприкінці 1980-х років під час перших спроб секвенування геному кишкової палички японські дослідники виявили щось дивовижне — ділянки ДНК, що містять множинні ідентичні повтори, розділені неідентичними, унікальними ділянками — спейсерами (рис. 1, 2). Подібні ділянки стали виявляти і в інших прокаріотах. Після низки проміжних імен їх зрештою назвали CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, згруповані регуляторні розділені проміжками короткі паліндромні повтори. Вони є приблизно у 40% бактерій і майже у всіх архей.

Ріс. 2. Дозрівання crPHK у CRISPR-системі II типу. Довгий незрілий попередник (пре-crPHK) складається з чергованих повторів (показані чорним) і спейсерів (показані зеленим). Окремо синтезована некодуюча РНК (tracrPHK) комплементарна ділянці повторення. До повторів вона і приєднується, що призводить до розрізання області повтору за допомогою РНКази III в присутності білка Csn1. Це перший етап процесингу. На наступному етапі не до кінця з’ясованим поки чином від отриманих обрізків відрізаються ще шматочки, в результаті чого і виходить повністю дозріла crPHK. Зображення зі статті Elitza Deltcheva et al., 2011. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III

Функція CRISPR довгий час залишалася неясною. Однак практична користь від CRISPR була отримана і без розуміння їх ролі: оскільки набір спейсерів унікальний для кожного штаму, то з їх допомогою можна ідентифікувати штами; на цьому, наприклад, заснований метод споліготипування мікобактерій туберкульозу, широко застосовується в епідеміології для ідентифікації джерела збудника і визначення вогнища інфекції.

Але для чого потрібні ці загадкові CRISPR самим клітинам? Те, що вони так широко поширені в прокаріотичному світі, означало, що вони роблять щось дуже важливе, що необхідно майже всім прокаріотам. Але що? Цього ніхто не знав.

Розгадка могла таїтися в нуклеотидній послідовності CRISPR, і особливо в послідовності унікальних, не повторюваних ділянок — спейсерів. На жаль, до певного часу дослідження цих коротких нуклеотидних послідовностей не давали ніяких результатів. Здавалося, що спейсери кодують якусь абракадабру, яка нічому не відповідає, нічого не визначає і ні для чого не потрібна.

І ось близько десяти років тому виявилася одна цікава і дивна річ. Виявилося, що послідовності спейсерів даного виду прокаріот підозріло часто збігаються з послідовностями геномів вірусів, які вражають цей вид. Такий дивовижний збіг говорив про те, що CRISPR-система — це щось на зразок прокаріотичного набутого імунітету, який дозволяє запам’ятати ворога і впоратися з ним при повторному зараженні. Приємно відзначити, що важливу роль у розгадці функції CRISPR зіграв наш колишній співвітчизник Євген Кунін.

CRISPR-система: придбаний імунітет прокаріот

Наразі відомо кілька типів CRISPR-систем. Розгляньмо спочатку роботу CRISPR системи, характерну для кишкової палички Esherichia coli.

При транскрипції CRISPR-касети отримуються короткі некодуючі РНК — crPHK, кожна з яких складається з спейсера, оточеного двома ділянками повтору (рис. 1). Якщо клітку заражає вірус, послідовність ДНК якого комплементарна послідовності спейсера однієї з crPHK, то клітина зможе пережити інфекцію.

Спейсер crPHK за допомогою комплексу особливих Cas-білків, який називається Cascade, приєднується до комплементарної ділянки вірусної ДНК — протоспейсеру (для цього необхідно ще, щоб перед протоспейсером в чужорідній ДНК перебувала коротенька нуклеотидна послідовність — PAM, protospacer associated motif). Після цього до комплексу підпливає ще один cas-білок — Cas3, ендонуклеазу/хеліказу, яка вносить до ДНК вірусу двоцепочковий розрив (рис. 3, B). В результаті чужорідна ДНК виявляється пошкоджена, вірусна інфекція припиняється, а клітина «здобуває перемогу» і залишається в живих.

Ріс. 3. Механізм роботи CRISPR-системи I і II типу. У системі I типу (внизу) до процесу розрізання залучено велику кількість компонентів. crPHK пов’язується з великим допоміжним білковим комплексом під назвою Cascade, який утворений деякими з cas-білків (гени білків, що утворюють цей комплекс, на рис. 1 показані жовтим). Виявивши комплементарну ДНК-послідовність (протоспейсер), crPHK за допомогою Cascade приєднується до неї; це викликає активацію ферменту Cas3 (кодуючий його ген на рис. 1 показаний помаранчевим), який розрізає чужорідну ДНК і цим рятує клітку. У системі II типу (вгорі) компонентів менше: комплекс tracrPHK-crPHK з’єднується з протоспейсерною ділянкою чужорідної ДНК, а фермент Cas9 розрізає обидві нитки цієї ДНК за допомогою своїх доменів HNH і RuvC. Зазначимо, що в обох випадках для того, щоб crPHK могла приєднатися до протоспейсера, перед цим протоспейсером повинна знаходитися коротенька ділянка під назвою PAM (protospaser adjancent motif; на даному малюнку названо просто motif). Зображення з синопсису Stan J. J. Brouns, 2012. A Swiss Army Knife of Immunity

Приблизно так само влаштована і робота CRISPR-системи іншого типу, характерної, наприклад, для бактерії Streptococcus thermophilus, що використовується для виробництва багатьох молочнокислих продуктів, проте компонентів в ній менше і влаштована вона простіше. Дозрівання crPHK забезпечується короткою некодуючою РНК (trans-activating crrRNA або tracrPHK), комплементарною ділянкою повтору, і широко поширеним клітинним ферментом РНКазою III (див. Ribonuclease III), а також допоміжним білком Csn1 (рис. 2). Атака на чужорідну ДНК проводиться за допомогою тієї ж tracrPHK і ендонуклеази Cas9 (рис. 3, А).

Прокаріотична CRISPR-система захисту від вірусів дуже схожа на еукаріотичну систему РНК-інтерференції, яка також бере участь в антивірусному захисті і використовує для цього приблизно той же прийом — приєднання до небажаної мРНК короткого комплементарного РНК-ділянки і подальше вимикання цієї непотрібної мРНК тим чи іншим способом (наприклад, її можна розрізати.

Часто crPHK примудряються зв’язатися навіть з не повністю комплементарною послідовністю ДНК вірусу, за умови що є підходяща PAM-ділянка і початок протоспейсера повністю комплементарно послідовності спейсера (рис. 4). Таким чином, один спейсер може одночасно забезпечувати захист проти декількох схожих вірусів. Це зручно і дозволяє заощадити місце в маленькому прокаріотичному геномі.

Ріс. 4. Схема зв’язування crPHK з чужорідною ДНК. Для цього зв’язування достатньо, щоб комплементарною була тільки початкова ділянка протоспейсера (вона називається seed) і щоб перед протоспейсером знаходився «правильний» PAM. Зображення зі статті Semenova et al., 2011. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence

Однак що ж робити, якщо клітина ніколи раніше не зустрічалася з даним вірусом і не має crPHK з впізнаючим його спейсером? Невже вона приречена? Невже вірус в цьому випадку здобуде перемогу?

Не зовсім так. Звичайно, велика частина «наївних» бактерій буде знищена вірусом. Однак деякі клітини примудряться з ним впоратися — і ось яким чином (рис. 5): заражені вірусом бактеріальні клітини починають гарячково вирізати всі потрапили під руку (точніше — під фермент) ділянки ДНК і вставляти їх у CRISPR-касету в якості спейсерів (важливу роль у цьому процесі відіграють ще два Cas-білки — Cas1 і Cas2).

Ріс. 5. Підсумкова схема роботи CRISPR-системи на прикладі інфекції бактерії E. coli фагом M13.

1. Все починається з того, що фаг нападає на недосвідчену, не зустрічалася раніше з даним збудником бактерію і впорскує в неї свою ДНК. (На малюнку показаний тільки один нападник фаг і тільки одне колечко його ДНК, яке опинилося в клітці, проте насправді нападників фагів і впорснутих ними ДНК набагато більше.) У відповідь бактерія за допомогою Cas1/Cas2-білків починає гарячково вирізати всі-ліпші ділянки ДНК — як фагові, так і свої власні, господарські — і вставляти їх як спейсерів у CRISPR. Якщо бактерії пощастило і вона вирізала правильний шматочок з фагової ДНК, то…

2. Інфекція викличе реакцію відповідної crPHK, Cascade-комплексу і Cas3 (детально показану на рис. 2 і 3), в результаті чого фагова ДНК буде знищена. Однак фаги теж не ликом шиті, вони теж хочуть виграти цю війну. Варто фагу мутація показана червоною точкою, як crPHK перестане їх розпізнавати, і вони невидимими проникнуть у клітку і почнуть робити свої чорні справи. Здавалося б, клітина приречена, але..

. 3. Навіть недостатньо комплементарний шматочок фагової ДНК активує CRISPR-систему, причому вирізання ДНК-фрагментів буде проводитися вже саме з фагової ДНК. Судячи з усього, забезпечується це тим, що Cas1/Cas2-комплекс навіть при некріпкому, недостатньо комплементарному приєднанні crPHK до ДНК фага починає ковзати по цій ворожій ДНК, вирізаючи з неї один шматочок за іншим, поки не попадеться ділянка, що підходить на роль «правильного» спейсера. Цей спейсер і врятує клітку від зараження

. Зображення зі статті Kirill A. Datsenko et al., 2012. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system

Велика частина вставлених ділянок виявиться марною або навіть шкідливою (наприклад, вставка в якості «портрета ворога» ділянки бактеріальної ДНК призведе до загибелі клітини за рахунок розкусу власної ДНК); однак деякі «щасливчики» випадково вставляють в якості CRISPR-спейсера фрагмент вірусної ДНК, що дає можливість синтезувати захисну crPHK і перемогти вірус. Цей новий спейсер вони передадуть всім своїм нащадкам, і тому від даного вірусу їх нащадки будуть захищені. Взагалі, набір спейсерів у цій клітці — це, в якомусь сенсі, її історія, пам’ять про колишні, виграні, бої з вірусами.

Але це ще не все. Виявляється, вставка спейсерів відбувається за принципом позитивного зворотного зв’язку, тобто вставка одного спейсера різко стимулює вставку наступних спейсерів з ДНК донора. Так, експерименти, проведені в лабораторії К. В. Северинова, показали, що якщо у даної бактерії є спейсер до даного вірусу, повторне зараження цим вірусом викликає спрямовану вставку додаткових спейсерів з ДНК вірусу. Іншими словами, якщо бактерія вже атакувалася раніше вірусами, то наступні атаки вона перенесе легше, тому що у неї буде здатність ідентифікувати чужорідну ДНК і вставляти нові спейсери. Щось схоже на вакцинацію, правда?

Практичне застосування

Яку ж практичну користь можна отримати зі знань про роботу CRISPR-системи? Величезну, і в безлічі областей.

Почнемо з того, що прокаріотичні клітини активно використовуються людьми для різних речей — візьмемо хоча б усім відомі кисломолочні бактерії. Зрозуміло, що одна з найжахливіших речей, яка може статися при виробництві кисломолочних продуктів, — це атака бактеріофагів, які знищують бактеріальну культуру. Однак якщо ми знаємо, як захистити бактерії від цієї атаки, то проблем з виробництвом кисломолочних продуктів не буде.

Водночас інші бактерії, навпаки, можуть завдати людині, тваринам або рослинам серйозної шкоди. Однак якщо ми знаємо, як вони захищаються від атак бактеріофагів, то можемо перешкодити їм це робити — і так врятуватися від бактеріальної інфекції.

Нарешті, є ще третє, на рідкість перспективне, застосування CRISPR-системи. З її допомогою можна з небаченою досі акуратністю редагувати геноми вищих організмів, включаючи людину. Про це нещодавно вийшли дві статті в Science (Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems; Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9), і на цьому я зупинюся поподробней.

Найточніші ножиці для геному

Для того щоб «відредагувати» якесь місце в ДНК, наприклад виправити мутацію, що призводить до генетичного захворювання, треба спочатку це місце розрізати. При цьому розрізний фермент — ендонуклеаза — повинен мати найвищу специфічність, тобто різати ДНК у потрібному місці і тільки в ньому (тому що розрізання ДНК у непотрібному місці може призвести до абсолютно непотрібних наслідків). А значить, ділянка ДНК, за якою розпізнається це потрібне місце, повинна бути якомога довшою — адже чим вона довша, тим менша ймовірність, що така ж ділянка зустрінеться десь ще на просторах геному і що там теж пройдуться «ножиці» ендонуклеази.

І ось так як захисний комплекс CRISPR-систем пов’язується з відносно довгими (не менше 20 нуклеотидів) ділянками ДНК, відповідними спейсерам, то виникає можливість досягти високої специфічності редагування.

За основу своєї розробки обидві групи авторів опублікованих в Science статей взяли просто влаштовану систему з Streptococcus thermophilus, що складається всього з чотирьох обов’язкових елементів — tracrPHK, crPHK, РНКази III і Cas9 (рис. 3, А). Чим менше компонентів, тим простіше працювати з системою і тим вище шанс, що система запрацює в нестандартних для себе умовах роботи в еукаріотичній клітці. Дослідникам вдалося ще більше спростити систему. По-перше, вони створили «хімерну» tracr-crPHK, яка працювала нітрохи не гірше, ніж tracrPHK і crPHK, що синтезуються окремо (рис. 6). По-друге, вони виявили, що бактеріальна РНКаза III для роботи системи не обов’язкова, оскільки її функцію можуть виконують «місцеві» РНКази, що синтезуються в еукаріотичній клітці.

Ріс. 6. «Хімічна» РНК має всі ключові фрагменти crPHK і tracrPHK, необхідні для правильного функціонування в клітці: напрямну послідовність (найбільш значуща ділянка спейсера, що зв’язується з ДНК) і ділянка повтору, пов’язана зі шматочком tracrPHK. Така «химера» набагато простіше за структурою, ніж дві окремі молекули crPHK і tracrPHK, а працює приблизно з тією ж ефективністю. Зображення зі статті Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Схожу структуру отримали і дослідники з другої групи (Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9)

Таким чином, для того щоб розрізати в клітці ДНК в потрібному місці, потрібно було зробити зовсім небагато:

1) Поставити послідовність, комплементарну цьому «потрібному місцю», в якості спейсера в CRISPR-касету і отримати хімерну tracr-crPHK.

2) Запустити експресію цієї CRISPR-касети і білка Cas9 у відповідній клітці, забезпечивши їх сигналом ядерної локалізації (NLS), щоб вони не «тинялися без толку» за цитоплазмою, а пливли прямо в ядро, де, власне, і знаходиться ДНК.

Система в роботі на клітинних культурах показала відмінні результати: з її допомогою можна як видаляти з ДНК якісь ділянки, так і вставляти туди нові області. CRISPR-система показала кращу ефективність, ніж попередні «фаворити» в цій області — цинковопальцеві нуклеази (див. Zinc finger nuclease) і TALEN. Не можна, звичайно, говорити про те, що CRISPR-система дозволить робити з геномом все, що тільки захочеться досліднику, але, мабуть, з усіх існуючих методик вона найбільш близька до цього.

Джерела:

1) Лекція К. В. Северинова на Зимовій школі FutureBiotech.

2) Le Cong, F. Ann Ran, David Cox et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science. V. 339. P. 819–823.

3) Prashant Mali, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 // Science. V. 339. P. 823–826.

4) John van der Oost. New Tool for Genome Surgery // Science. V. 339. P. 768-770 (синопсис до двох вищевказаних статей)

.5) Kirill A. Datsenko, Ksenia Pougach, Anton Tikhonov et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system // Nature Communications. V. 3. Article number: 945. Published 10 July 2012

.6) Ksenia Pougach, Ekaterina Semenova, Ekaterina Bogdanova et al. Transcription, Processing, and Function of CRISPR Cassettes in Escherichia coli // Mol Microbiol. V. 77. P. 1367–1379.

Віра Башмакова