РНК у позаклітинних везикулах зовсім не схожа на клітинне сміття

Ріс. 1. Фотографії екзосом (субпопуляція позаклітинних везикул розміром від 30 до 100 нм) після ультрацентрифугування (ліворуч) і після очищення за допомогою градієнта цукрози (праворуч, див. врізку «Екзосоми зразкової чистоти»). Зафарбовані трикутники вказують на білкові забруднення препарату екзосом, а незакарбований — на позаклітинну везикулу розміром більше 100 нм. Відмінна риса екзосом — «чашеобразна» форма. Екзосоми були отримані з модельної лінії клітин людини HEK293T, яка широко використовується для вивчення різних аспектів клітинної біології. Фотографії зроблені за допомогою електронного мікроскопа при збільшенні 9300X. Зображення зі статті M. J. Shurtleff et al., 2016. Y-box protein 1 is required to sort microRNAs into exosomes in cells and in a cell-free reaction

Позаклітинні везикули — це різнорідна група невеликих мембранних бульбашок, оточених ліпідною мембраною і містять в собі ліпіди, білки і РНК. Багато років вчені вважали, що за допомогою везикул клітини позбавляються від внутрішньоклітинного сміття, і тільки відкриття останніх років дозволили оцінити потенціал позаклітинних везикул як важливих переносників інформації між клітинами і як засоби для виявлення різних захворювань. Але серед вчених немає одностайності ні з приводу оптимального протоколу для виділення позаклітинних везикул, ні з приводу їх складу. Нова робота американських вчених, серед яких і Нобелівський лауреат Ренді Шекман, має всі шанси закласти фундамент для розуміння того, які саме РНК входять до складу позаклітинних везикул і як ці РНК туди потрапляють.

Без постійного обміну інформацією неможливо собі уявити координоване співіснування клітин багатоклітинних організмів. Важливість такого обміну, що відбувається на різних рівнях, складно переоцінити. Він може відбуватися як за рахунок безпосереднього контакту, так і за допомогою виділення різних молекул і мембранних утворень у позаклітинний простір. До перших можна віднести, наприклад, фактори росту і гормони, а до других — позаклітинні везикули, про які ми поки знаємо дуже мало і про які далі піде мова.

Зараз відомо, що позаклітинні везикули виробляються всіма без винятку клітинами нашого організму. Це крихітні — розміром від 30 до 5000 нм — бульбашки, в яких знаходяться ліпіди, білки і РНК. Вміст цих бульбашок оточений двошаровою ліпідною оболонкою, яка є похідною клітинною мембраною. Перші експериментальні спостереження позаклітинних везікул були зроблені ще в 1946 році. Тоді вони були виявлені як тромбоцитарні частинки, що сприяють згортанню крові. Тільки через 40 років вдалося зрозуміти, як саме утворюються ці частинки. У 1983 році при вивченні ретикулоцитів було помічено, що схожі частинки формуються в мультивезикулярних тільцях (див. Multivesicular body, або Ендосома) всередині клітин.

Класифікація позаклітинних везикул заснована на їх походженні (і, побічно, на розмірах). Так, екзосоми (зазвичай від 30 до 100 нм, рис. 1) утворюються якраз у мультивезикулярних тільцях. Мікровезікули (Microvesicles, від 100 до 1000 нм) просто відмовляються від клітинної мембрани в позаклітинний простір. Апотельця (понад 1000 нм) — це і зовсім клітинні фрагменти, що утворилися в результаті апоптозу. Протягом десятиліть переважала думка, що для клітин позаклітинні везикули — всього лише спосіб позбутися внутрішньоклітинного сміття. Таке ставлення поступово відходить у минуле. Причина тому — зростаюче розуміння, що ліпідна мембрана цих бульбашок приховує від агресивних ферментів міжклітинного простору (швидше за все) функціональні ліпіди, білки і РНК. Детальніше про везикули розказано в статтях Екзосоми — пляшкова пошта організму і Клітини організму спілкуються за допомогою послань, упакованих у мікровезікули.

Незважаючи на відносно великий прогрес у вивченні позаклітинних везикул, багато питань залишаються без відповіді. Наприклад, немає надійного способу розділення екзосом, мікровезікул і апотелець. Незрозуміло, як себе ведуть позаклітинні везикули в організмі, а не в культурах клітин. Залишається загадкою, який саме з компонентів позаклітинних везикул відповідає за ті чи інші реакції в клітинах, які отримують ці везикули, і які механізми при цьому задіюються. І все ж головним завданням залишається вироблення чіткого уявлення про те, які РНК, а також ліпідні і білкові молекули переносяться позаклітинними везикулами і як ці молекули виявляються всередині везикул.

Нефрагментовані РНК у позаклітинних везикулах

У роботі, опублікованій нещодавно в журналі PNAS, вчені з Каліфорнійського університету в Берклі (з групи лауреата Нобелівської премії 2013 року Ренді Шекмана на чолі з ним самим, див. Нобелівська премія з фізіології та медицини — 2013, «Елементи»,   і з Техаського університету в Остіні зробили спільну спробу найбільш ретельно охарактеризувати молекули РНК з позаклітинних везікул, а також із субпопуляції цих тетикул — екзосічний, класичний, класний. Здавалося б, що в цьому особливого? І правда — нічого (схожі експерименти проводили і раніше), якщо не враховувати, яким методом було проведено РНК-секвенування.

Для початку, що все-таки вдалося дізнатися? По-перше, — і цей результат узгоджується з попередніми дослідженнями — найчисленнішими виявилися короткі некодуючі РНК (62%), рибосомні РНК (рРНК, 27%), і РНК білок-кодуючих генів (мРНК, 6,6%), а на всі інші біотипи припало всього 4,4%. З коротких некодуючих РНК краще за інших були представлені транспортні РНК (тРНК, 80% коротких РНК) і Y-РНК (14% коротких РНК), тоді як частка мікроРНК склала менше 0,5% від усіх секвенованих послідовностей (рис. 2, A). Також виявилося, що біотипи РНК представлені приблизно однаково в позаклітинних везикулах (рис. 2, А) і в їх субпопуляції — CD63 + -екзосомах (рис. 2, B). З цієї причини автори в подальших експериментах використовували тільки екзосоми, сконцентрувавшись таким чином на більш однорідному матеріалі.

Ріс. 2. Біотипи РНК, представлені в позаклітинних везикулах (A) і CD63 + -екзосомах (B). Ліворуч показано всі виявлені біотипи РНК (Total RNA), а праворуч — біотипи тільки коротких некодуючих РНК (Small ncRNA). З цього малюнка видно, що за складом РНК CD⁶3 + -екзосоми дуже схожі на позаклітинні везикули. Mt — транскрипти мітохондріальних генів, Protein-coding — білок-кодуючі, або матричні РНК (мРНК), Pseudogene — псевдогени, rRNA — рибосомні РНК, Antisense — довгі некодуючі РНК, гени яких перекриваються з іншими генами на антикомпліментній Словномові (СНК, ГЕНК), генИ. tRNA — транспортні РНК, Vault RNA — РНК з органели Vault, miRNA — мікроРНК, snoRNA — малі ядришкові РНК, snRNA — малі ядерні РНК, Other snRNA — інші короткі РН. У дужках вказано кількість генів для кожного біотипу. Зображення з обговорюваної статті в PNAS

Сюрпризом стало те, що більшість секвенованих тРНК та інших коротких РНК мали повну довжину і зовсім не були фрагментовані, як передбачалося на основі раніше опублікованих даних. Хтось припускав, що фрагменти коротких РНК — це продукти деградації або ж токсичні продукти метаболізму клітин, хтось — що це їх нові функціональні похідні. Виявилося ж, що цих фрагментів просто немає в позаклітинних везикулах в скільки-небудь значущих кількостях!

Чому ми дізнаємося про нефрагментовані РНК у позаклітинних везикулах тільки зараз, після багатьох років експериментів? І чи виходить, що всі інші помилялися? Дуже схоже, що так. Як так вийшло? Відповідь досить проста, але в той же час здатна зробити невелику революцію в підході до секвенування РНК, зокрема — коротких некодуючих РНК. Автори обговорюваної статті просто задалися питанням: «А що якщо ми неправильно все секвенуємо?».

Справа ось у чому. Найбільш популярна на даний момент платформа для РНК-секвенування не використовує для секвенування безпосередньо РНК. Замість неї використовується комплементарна ДНК (кДНК), синтезована з матриці РНК ферментом зворотною транскриптазою (Reverse transcriptase). У свою чергу, зворотна транскриптаза має один істотний недолік — вона погано зчитує послідовності РНК, які беруть участь в утворенні вторинних структур. При підвищених температурах вторинна структура РНК руйнується, але синтезувати кДНК за таких умов звичайні зворотні транскриптази не можуть. Потрібна не проста, а термостабільна зворотна транскриптаза.

Через свої маленькі розміри позаклітинні везикули практично не вміщують довгих РНК. А як на зло, короткі РНК (до 200 нуклеотидів у довжину), наприклад тРНК, часто володіють дуже стабільною вторинною структурою і численними модифікаціями. Це важливо для їх участі в транспорті амінокислот до рибосомів, але при цьому сильно ускладнює зворотну транскрипцію. Звичайній зворотній транскриптазі такі РНК часто не під силу. Проблему зворотної транскрипції РНК зі стабільною вторинною структурою вдалося вирішити використанням термостабільної зворотної транскриптази GsI-IIC RT (або thermostable group II intron reverse transcriptase-III, TGIRT-III), а метод РНК-секвенування назвали TGIRT. Цей метод дозволив зчитувати послідовності РНК від початку до кінця, адже тепер вторинна структура не викликала припинення синтезу кДНК.

Незважаючи на використання термостабільної зворотної транскриптази, вчені помітили, що група послідовностей екзосомних тРНК все ж була на 15 нуклеотидів коротше тРНК повної довжини. Оскільки зчитування РНК при зворотній транскрипції йде від кінця молекули до початку, зупинка повинна була відбуватися в ділянці тРНК, званій D-петлею (D-arm, рис. 3, A). Оскільки синтез кДНК тепер здійснювався при підвищеній температурі, навряд чи проблемою була вторинна структура.

Вчені припустили, що така зупинка може бути результатом модифікації заснування РНК у цій позиції. Вони скористалися тим, що різні зворотні транскриптази сімейства TGIRT відрізняються своєю здатністю читати модифіковані нуклеотиди. Коли вони провели синтез кДНК двома різними TGIRT-ферментами, то один (GsI-IIC RT або TGIRT-III, рис. 3, B), як і раніше зупинявся в 15 нуклеотидах від початку тРНК, тоді як інший (TeI4c RT, рис. 3, С) — ні. Тому дослідники дійшли висновку, що в цій позиції у екзосомних тРНК знаходиться нуклеотид з невідомою модифікацією. Цим нуклеотидом міг бути дигідроурідін, що цілком зазвичай для D-петлі тРНК. Проти цього говорять два спостереження: по-перше, відомо, що TGIRT-ферменти можуть легко зчитувати дигідроурідін, а по-друге, зупинки за 15 нуклеотидів не було помічено у випадку з внутрішньоклітинними тРНК.

Ріс. 3. A — структура тРНК, показані D-, T- і антикодонова петлі; 5 «означає початок молекули, 3» — її кінець. Приблизне положення нуклеотиду з невідомою модифікацією показано червоною ламаною лінією. B і C — розподіл довжин послідовностей тРНК після секвенування РНК з використанням двох термостабільних зворотних транскриптаз — GsI-IIC RT (також відомої як TGIRT-III) і TeI4c RT. При секвенуванні клітинної РНК (Whole cells, блакитні графіки) всі послідовності відповідають тРНК повної довжини (пік Full length) незалежно від типу зворотної транскриптази. Водночас, при секвенуванні екзосомної РНК (Exosomes, червона лінія) GsI-IIC RT зупиняється за 15 нуклеотидів до початку тРНК (графік B, пік tRNA *), а TeI4c RT — ні (зворотна транскрипція відбувається від кінця молекули РНК (3 «) до її початку) (5. Малюнок з обговорюваної статті в PNAS

Виходить, що тільки екзосомні тРНК мають таку модифікацію, і це — не дигідроурідін, а щось зовсім нове. Важливо підкреслити, що цієї модифікації немає у внутрішньоклітинних РНК. З цього може випливати, що всі тРНК, які мають таку модифікацію автоматично відправляються в екзосоми. При цьому автори не виключають і можливості, що модифікація нуклеотиду в цій позиції відбувається прямо в екзосомах! Чи є дана модифікація умовою або результатом приміщення тРНК в екзосоми — покажуть подальші дослідження.

Насправді, нічого дивного в тому, що РНК в екзосомах не фрагментовані немає. Подвійний ліпідний шар надійно захищає екзосомні РНК від усього, що знаходиться в позаклітинному просторі, включаючи різні руйнуючі РНК ферменти (РНКази). Цікаво, що, якщо додати до препарату екзосом трохи розчинника, щоб порушити цілісність їх ліпідних мембран, і таким чином дозволити також доданим РНКазам потрапити всередину, повного руйнування всіх екзосомних РНК все одно не відбувається. Так, наприклад, RNY3, VTRNA1-1, C/D-box малі ядришкові РНК, 5S рРНК, і U5 РНК були стійкі до такої обробки. Автори зробили висновок, що ці РНК перебувають в екзосомах у складі рібонуклеопротеїнових комплексів, що захищають їх від РНКаз. У той же час інші РНК швидше за все знаходяться всередині екзосом у вільному стані, і біологічні причини цього поки залишаються загадкою.

Довгі РНК в екзосомах — відносно короткі

Багато послідовностей, отриманих за допомогою РНК-секвенування, мабуть, є результатом присутності ДНК-забруднення препаратів екзосом. Використовувавши різні комбінації обробок розчинником, протеазами (щоб зруйнувати білки) і нуклеазами (щоб зруйнувати РНК або ДНК), автори показали, що ДНК насправді може «прилипати» до поверхні екзосом зовні. Чи є це біологічно важливим явищем або артефактом протоколу отримання екзосом — поки незрозуміло. Наявність ДНК-забруднення може проявлятися, наприклад, у присутності в результатах РНК-секвенування інтронних послідовностей з білок-кодуючих генів.

Обробка препарату екзосом ДНКазою дозволила позбутися ДНК-артефактів і переконатися в тому, що деякі транскрипти білок-кодуючих генів все ж дійсно знаходяться в екзосомах. Звертає на себе увагу те, що більшість екзосомних мРНК коротше 1500 нуклеотидів у довжину, що не дивно, якщо ми згадаємо, що екзосоми — дуже маленькі везикули. Серед мРНК, найбільш часто зустрічалися ті, що кодують рибосомні білки або інші білки, які беруть участь у трансляції. Ці мРНК містять 5 «-термінальні олігопиримідинові послідовності (5. Terminal oligopyrimidine, 5. TOP), які дозволяють координовано регулювати ці транскрипти на етапі їх трансляції. Вчені вважають, що це — потенційний зв’язок між повідомленнями в екзосомах і клітинним метаболізмом як тих, що виділяють, так і приймають екзосоми клітин.

Екзосоми зразкової чистоти

Те, наскільки мало ми знаємо про позаклітинні везикулі, добре ілюструє факт: ми досі не дійшли компромісу з приводу оптимального способу їх виділення і очищення. Всі використовувані на сьогоднішній день методи мають як яскраво виражені переваги, так і істотні недоліки. Знаходження оптимального методу особливо важливе, тому що позаклітинний простір містить величезну кількість РНК, пов’язаних з різними білками. Ці комплекси можуть істотно забруднювати препарати позаклітинних везикул, і, як наслідок, препарати їх РНК.

На щастя, до цієї проблеми вчені також підійшли у всеозброєнні. По-перше, вони сконцентрувалися на субпопуляції позаклітинних везікул — CD63 + -екзосомах. Далі, вони використовували потрійне очищення екзосом — за допомогою ультрацентрифугування при прискоренні в 100 000 g, градієнта цукрози і селекції за допомогою антитіл (рис. 4). Центрифугування з великим прискоренням облагає позаклітинні везикули, відокремлюючи їх за масою від більшості білкових комплексів, що забруднюють препарат (див. рис. 1, A). Потім позаклітинні везикули поміщаються в 60-відсотковий розчин цукрози і поверх нього наносяться три шари цукрози менших концентрацій (40%, 20% і 0%). При центрифугуванні за рахунок своєї щільності (1,15-1,19 г/мл) екзосоми спливають до межі шарів цукрози з концентраціями 40% і 20%. На останньому етапі з препарату позаклітинних везикул за допомогою антитіл до тетраспанина CD63 відловлюється субпопуляція екзосом, що містить його у своїх мембранах.

Ріс. 4. Схема описаних у статті експериментів з очищення препарату позаклітинних везикул. Середа клітин HEK293T, що містить позаклітинні везикули, була піддана кільком раундам центрифугування, після чого осад був відокремлений від білкових забруднень за допомогою цукрозного градієнта. З отриманого таким чином очищеного препарату позаклітинних везикул далі були очищені CD63 + -екзосоми та їх РНК для TGIRT-seq. Зображення з обговорюваної статті в PNAS

Такий ретельний підхід дозволяє стверджувати, що представлений в обговорюваній статті препарат екзосом, мабуть, один з найчистіших з описаних у літературі на даний момент, а отримані авторами відомості про склад і механізм сортування екзосомних РНК є великим кроком назустріч кращому розумінню функцій екзосом і позаклітинних везикул взагалі. Проте ми не знаємо, чи всі екзосоми містять тетраспанин CD63 і чи входить він до складу мембран мікровезікул. Таким чином, питання про отримання не забрудненого іншими видами везикул препарату всіх екзосом (а не їх субпопуляції) залишається відкритим.

Як же все-таки РНК потрапляють в екзосоми? Як і в багатьох питаннях, що стосуються екзосом (і позаклітинних везикул взагалі), існує безліч розрізнених досліджень, які намагаються відповісти на це питання, використовуючи приклади окремих РНК. Однак до цього моменту не було виведено жодних закономірностей. Автори стверджують, що у випадку з короткими РНК це відбувається за допомогою білка YBX1, який також присутній в екзосомах, хоча механізм його роботи поки не ясний. Так, тРНК, Y-РНК і Vault РНК накопичувалися в клітинах, нокаутних за YBX1, не потрапляючи в їхні екзосоми. Відомо, що рівні експресії YBX1 підвищені в пухлинах. У це може бути складно повірити, але ми знаємо, що позаклітинні везикули з пухлин можуть перетворити нормальну клітку на ракову (M. A. Antonyak et al., 2011. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells). В такому випадку, роль YBX1 в міжклітинній комунікації та регуляції пухлинного мікроокруження може бути дуже важливою. При цьому залишається незрозумілим, як в екзосоми потрапляють мРНК, оскільки нокаут YBX1 ніяк не впливає на їх присутність в екзосомах.

Що ми маємо в підсумку? У позаклітинних везикулах РНК представлені короткими некодуючими РНК в повну довжину. Більшість з них — тРНК, мають відмінну модифікацію в D-петлі, якої немає у клітинних тРНК. Важливо, що короткі РНК сортуються в екзосоми за допомогою спеціального білка YBX1. Все це свідчить на користь гіпотези про те, що екзосоми (і, швидше за все, інші позаклітинні везикули) — це не просто «мішки з клітинним сміттям». Більше схоже на те, що це ретельно зібрані посилки від одних клітин — іншим. Проте автори не відкидають можливості, що YBX1 пов’язується саме з пошкодженими, нефункціональними або такими, що просто перебувають у надлишку, короткими некодуючими РНК і направляє їх в екзосоми, якщо вони не пов’язані зі своїми звичайними білковими партнерами. РНК в екзосомах потім можуть подорожувати до інших клітин, доповнюючи або регулюючи їх метаболізм або ж викликаючи реакції клітинного імунітету.

Якщо у вас є докладна інструкція зі складання, скажімо, автомобіля, то ви, цілком ймовірно, зможете розібратися в його пристрої. Але що робити, якщо у вас є не інструкція цілком, а тільки випадкові фрагменти її сторінок? Несподівано для себе, більшість вчених, які вивчають позаклітинні везикули, опинилися в другій ситуації. Все через те, що, згідно з раніше опублікованими експериментальними даними, вважалося, що генетичний матеріал у позаклітинних везикулах (головним чином — короткі РНК) знаходиться у фрагментованому стані. Тепер у нас є не тільки докладна, цільна інструкція зі складання автомобіля, а й інструмент для тюнінгу (YBX1-залежний сортинг).

Джерело: Matthew J. Shurtleff, Jun Yao, Yidan Qin, Ryan M. Nottingham, Morayma M. Temoche-Diaz, Randy Schekman, and Alan M. Lambowitz. Broad role for YBX1 in defining the small noncoding RNA composition of exosomes // PNAS. 2017. DOI: 10.1073/pnas.1712108114.

Див. також:

Sybren L. N. Maas, Xandra O. Breakefield, Alissa M. Weaver. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles // Trends in Cell Biology. 2017. DOI: 10.1016/j.tcb.2016.11.003.

Динар Юнусов