Систему CRISPR-CAS9 вдалося зняти в дії

Ріс. 1. Механізм роботи системи Crispr-Cas. 1 — ділянка ДНК вірусу, яку клітина зустріла вперше (червона), вставляється в локус CRISPR, де вже зберігаються ділянки ДНК вірусів, які клітина зустрічала раніше (різнокольорові стрілки). 2 — на основі бібліотеки CRISPR створюються напрямні РНК, які утворюють комплекс з білком Cas (лілові овали). 3 — Коли комплекс Cas-РНК зустрічає вірусну ДНК (зелена), комплементарну направляючої РНК, він з’єднується з нею і знищує, розрізаючи на частини. Зображення з сайту gesundheitsindustrie-bw.de

Незважаючи на вже більш ніж десятирічну історію вивчення системи CRISPR-Cas і застосування її для редагування геному, досі ніхто не спостерігав її за роботою. Японські вчені усунули цю прогалину і першими в світі отримали відео цього процесу, використовуючи високошвидкісний атомно-силовий мікроскоп. При цьому з’ясувалося, що елементи системи зв’язуються з молекулами ДНК не так, як вважалося раніше: вони не повзають за цими молекулами в пошуках потрібного місця, а знаходять його за допомогою тривимірної дифузії.

Система CRISPR-Cas9, яка використовується для спрямованого редагування геному, завоювала велику популярність серед вчених. Кількість статей, в яких згадується ця система, стрімко зростає з кожним роком (починаючи з декількох статей у 2011 році і закінчуючи більш ніж двома тисячами статей у 2017 році).

Нагадаємо, що CRISPR-Cas — це імунна система бактерій. Подібно до нашої імунної системи, в якій є:

1) клітини пам’яті, завдання яких — запам’ятати «ворога» в обличчя і зберегти інформацію про нього (наприклад, особлива популяція лімфоцитів зберігає інформацію про раніше використану зброю проти збудника інфекції і формує вторинну імунну відповідь), 2)

клітини, які безпосередньо будуть боротися з ворогом (наприклад, Т-кілери), у бактерій

теж є механізм, спрямований на знищення збудників інфекцій. Тільки у бактерій за імунітет відповідають не окремі клітини, а спеціально пристосовані для цього нуклеїнові кислоти (ДНК і РНК) і білки. В основі імунної системи бактерії лежить CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) — комплекс повторюваних ділянок ДНК. Між ними знаходяться спейсери — роздільники з геномними фрагментами вірусів — генетичними «портретами» тих, з ким ця бактерія вже стикалася. Це — своєрідна база фотороботів порушників у геномі бактерії.

Працює вона так. Якщо в бактерію потрапив вірус, який вона до цього не зустрічала, і їй вдалося його побороти, то на пам’ять вона залишить невеликий шматок вірусної ДНК, який буде збережений в локусі CRISPR (рис. 1). Після цього необхідно перевести отриману від вірусу послідовність нуклеотидів у форму, здатну націлювати білки Cas. Для цього створюється так звана напрямна РНК (gRNA), яка повторює вставлений у базу шматок вірусної ДНК. Як правило, напрямні РНК створюються постійно і з досить низькою швидкістю, але при зіткненні клітини з вірусом або в стресових умовах швидкість значно збільшується. Після того, як РНК створена, вона зв’язується з комплексом білків Cas. Тепер комплекс Cas-gRNA подібно поліцейському з фотороботом злочинця, може патрулювати клітку. Коли знайдено шматок чужорідної ДНК, комплементарний напрямній РНК, комплекс зв’язується з цим шматком і білки Cas розщеплюють його, як пара молекулярних ножиць. Докладніше про цей молекулярний механізм див., наприклад, статтю Д. Е. Джагарова Розумні ножиці для ДНК.

Відкрита майже 30 років тому, більше 20 років ця система представляла інтерес тільки для молекулярних біологів, які намагалися зрозуміти властивості цього унікального захисного механізму. У 2012 році було виявлено потенціал систем CRISPR-Cas9 як інструменту для редагування геному, здатного ініціювати цілеспрямовані генетичні модифікації практично в будь-якому організмі. У наступні роки за допомогою цього методу вченим вдалося, наприклад, позбавити мишей генетичних захворювань (J. R. Mendell, L. R. Rodino-Klapac, 2016. Duchenne muscular dystrophy: CRISPR/Cas9 treatment), вилікувати тварин від ВІЛ (C. Yin et al., 2017. In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models) і навіть відредагувати геноми ембріона і дорослої людини (див. P. Liang et al., 2015. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes и популярную заметку D. Cyranoski Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial). Про історію та основні результати застосування цього методу читайте в новині Підбито підсумки першого десятиліття вивчення CRISPR («Елементи», 13.07.2017).

Незважаючи на суттєві успіхи, донині не було жодного прямого спостереження функціонування цієї системи. Цю прогалину вдалося усунути групі японських учених на чолі з Мікіхіро Шибатою (Mikihiro Shibata) за допомогою високошвидкісного атомно-силового мікроскопа (HS-AFM), який дозволяє отримувати зображення молекул і навіть окремих атомів. Стаття про дослідження опублікована в журналі Nature Communications.

За допомогою HS-AFM-візуалізації можна виявляти динаміку білків з фантастичною деталізацією. Наприклад, раніше вченим, серед яких були і деякі автори обговорюваної роботи, вдалося зафіксувати фотоіндуковані конформаційні зміни в молекулі бактеріородопсина (M. Shibata et al., 2010. High-speed atomic force microscopy shows dynamic molecular processes in photoactivated bacteriorhodopsin) і поспостерігати за молекулою міозину, що прогулюється по актиновій нитці (N. Kodera et al., 2010. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy).

Принцип роботи атомно-силового мікроскопа заснований на міжмолекулярній взаємодії між поверхнею досліджуваного зразка і зондом. Зонд — це нанорозмірне вістря, яке знаходиться на кінці упругої консолі, кантилевера. Сканована поверхня може притягувати або відштовхувати зонд, що призводить до вигину кантилевера (рис. 2). Цей вигин реєструється за допомогою лазера, який, відбиваючись від кантилевера, потрапляє на чутливий фотодетектор (подробиці — в статті А. Курамшина Поглянь на атоми, доторкнися до молекули). Високошвидкісна атомно-силова мікроскопія працює за таким же принципом. Різниця лише в тому, що використовується кантилевер, який у тисячі разів менше, ніж класичний АСМ, що дозволяє збільшити швидкість отримання зображень.

Ріс. 2. Схема роботи атомно-силового мікроскопа. Зображення з сайту simple.wikipedia.org

Вчені самі підготували необхідні молекули для дослідження. Білок Cas9 був синтезований в клітинах кишкової палички E. coli, а потім був очищений за допомогою колонічної хроматографії. Напрямну РНК і ДНК-мішень синтезували in vitro. Крім цього, була підготовлена спеціальна підкладка, на якій згодом розміщували біополімери. До підкладок, що використовуються для АСМ висуваються такі вимоги: поверхня повинна бути досить рівною і добре адсорбувати досліджувані об’єкти. При скануванні біомолекул найчастіше використовуються підкладки зі слюди. І хоча такі підкладки мають гідрофільну поверхню з атомарно-рівними ділянками розміром понад 100 мкм, вони володіють низкою недоліків, — наприклад, негативним зарядом поверхні (що може перешкодити в роботі з ДНК, оскільки фосфатні групи також мають негативний заряд) і здатністю придушувати вільну дифузію комплексів. Для подолання цих недоліків дослідники модифікували поверхню слюди двома різними способами:

1) обробляли поверхню слюди розчином APTES ((3-амінопропіл) тріетоксисилан), в результаті чого на поверхні слюди утворювалася плівка, яка у воді має позитивний заряд. 2)

формували ліпідний біслій на поверхні слюди, за рахунок чого мінімізувалися взаємодії між комплексом Cas9-RNK і слюдою.

Перше, що зробили японські вчені, — це спробували зняти білок Cas9 без направляючої РНК. Раніше зміни в білці Cas9, що відбуваються під час його роботи, вивчалися за допомогою рентгеноструктурного аналізу (РСА). Цей метод дозволяє отримати тривимірну структуру молекули, наприклад, білка (див. А. Оганов, 10 фактів про кристалографію). Якщо коротко, процес отримання зображення цим методом складається з таких етапів: виготовлення насиченого розчину білка, який пройшов очищення, процес кристалізації зразка, збір даних розсіювання рентгенівських променів і безпосередньо обробка даних, що включає в себе комп’ютерне моделювання.

Попередні дослідження показали, що молекула Cas9 у вільному стані має жорстку структуру. Щоб перевірити це, японські вчені взяли кристалічні моделі, отримані іншою групою дослідників, і порівняли їх зі своїми зображеннями, отриманими на АСМ. Виявилося, що вільний білок має рухливу структуру, відмінну від жорсткої структури, що спостерігається в кристалі (рис. 3, b, c). Тобто дані, отримані раніше за допомогою РСА, виявилися нерелевантними, оскільки не відповідають структурі білка в природному стані.

Ріс. 3. Кристалічні структури зліва направо: самотній Cas9, комплекс Cas9-RNK, Cas9-RNK, пов’язаний з одноланцюжковою ДНК-мішенню, і Cas9-RNK, пов’язаний з його мішенню (двоцепочковою ДНК). Різними кольорами позначені функціональні домени білка: сіро-білий шматок — альфа-спіральна лопата, рожевий — нуклеазний домен HNH, який розщеплює мішень ДНК, блакитний — нуклеазний домен RuvC, який розщеплює ланцюг нецільової ДНК, бежевий — PAM домен, що розпізнає спеціальний шматок ДНК-мішені. c і d — послідовні зображення, отримані за допомогою високошвидкісного атомно-силового мікроскопа: самотній Cas9 (c) і комплекс Cas9-RNK (d). Маленький хвостик, вказаний стрілкою, це шматочок РНК, що стирчить з альфа-спіральної лопаті. Шкали справа показують висоту об’єкта над підкладкою. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Потім дослідники зняли комплекс Cas9 з направляючої РНК. На відміну від самотнього білка, комплекс Cas9-RNK мав стабільну двопастну архітектуру, відповідну кристалічній структурі (рис. 3, b, d, див. також відео № 2 з додаткових матеріалів до обговорюваної статті).

Наступним кроком стала візуалізація пов’язування комплексу Cas9-RNK з ДНК-мішенню. Для початку на поверхню підкладки адсорбували всіх «учасників»: молекулярні комплекси Cas9-RNK і ДНК-мішені. На відео можна помітити, що комплекс Cas9-RNK специфічно зв’язується зі своєю ДНК-мішенню. Все це було проведено за відсутності іонів магнію Mg² +. Іони цього металу необхідні для правильної роботи нуклеаз, тому без магнію комплекс зв’язується з ДНК, але подальшого розщеплення не відбувається (рис. 4, див. також відео № 3 з додаткових матеріалів до обговорюваної статті).

Ріс. 4. Комплекс Cas9-RNK, специфічно (тобто в конкретному місці, в якому відбуватиметься розрізання) пов’язаний зі своєю мішенню за відсутності іонів Mg² +, не розрізає ДНК. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Щоб візуалізувати процес розриву ДНК, дослідники повторили попередній крок, але вже додали магній. Тоді білок Cas9 зміг розрізати ДНК. На відео продемонстровано, як після внесення двошіпочкових розривів частина ДНК вивільняється з комплексу (рис. 5 і відео).

Ріс. 5. Комплекс Cas9-RNK у присутності іонів Mg² + розрізає ДНК. Білі і рожеві стрілки вказують на нуклеазний домен NHN в неактивному і активному стані. Вивільнений кінець нитки ДНК показано блакитною стрілкою на останньому кадрі. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Комплекс Cas9-RNK розрізає молекулу ДНК

Через недостатню роздільну здатність зображень, на жаль, залишилося невідомим, як звільняється частина молекули ДНК, що залишилася в комплексі.

Також вченим вдалося спростувати теорію про те, як саме комплекс Cas9-RNK зв’язується з необхідною ділянкою на молекулі ДНК: раніше вважалося, що білок, пов’язаний з РНК, «ковзає» по ДНК у пошуках комплементарної ділянки. Для цього дослідники використовували підкладку з біліпідним шаром, щоб мінімізувати взаємодію між шаром і білком, яка може перешкодити вільній дифузії комплексу. Виявилося, що Cas9 без направляючої РНК зв’язується з молекулою ДНК і просто ковзає по ній. А ось коли у білка є РНК, комплементарна потрібній ділянці, комплекс не ковзає, а безпосередньо зв’язується з мішенню (рис. 6, див. також відео № 7 з додаткових матеріалів до обговорюваної статті). Мабуть, наявність направляючої РНК заважає комплексу Cas9-RNK «осідлати» ДНК, щоб ковзати по ній. Так що зв’язування відбувається за рахунок тривимірної дифузії: комплекси плавають в розчині, а якщо їм пощастить опинитися поруч з потрібною ділянкою ДНК, то вони з нею зв’язуються.

Ріс. 6. a — кілька білків Cas9 (позначені стрілками), у яких відсутня напрямна РНК, ковзають по молекулі ДНК. b — комплекс Cas9-RNK відразу ж зв’язується з потрібною ділянкою, як тільки виявляється поруч з ним через тривимірну дифузію. На другому кадрі видно кілька молекул ДНК, на одній з яких вже сидить комплекс Cas9-RNK (нижня стрілка), а на іншій зазначено місце, з яким згодом зв’яжеться інший комплекс (верхня стрілка). На четвертому і п’ятому кадрах добре видно, що Cas9-RNK з’являється в потрібному місці відразу, а не ковзає по ДНК. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Ці зернисті і, здавалося б, неказисті відео змушують вчених по всьому світу задихатися від захвату. З одного боку, система CRISPR-Cas9 працює так, як і передбачали раніше. З іншого боку, вже виявили нові подробиці в тому, як білковий комплекс пов’язується з правильною ділянкою ДНК. Загалом же це дослідження надає безпрецедентні подробиці про функціональну динаміку CRISPR-Cas9 і підкреслює потенціал високошвидкісної атомно-силової мікроскопії для з’ясування механізмів дії молекул, асоційованих з нуклеїновими кислотами.

Джерело: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, Takayuki Uchihashi & Osamu Nureki. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy // Nature Communications. 2017. DOI: 10.1038/s41467-017-01466-8.

Анастасія Пашутова