Тепловий потік через відкриту пору сприяє безперервній реплікації нуклеїнових кислот і відбору більш довгих ланцюжків

Ріс. 1. Локальне зниження ентропії є ключовою особливістю живих систем і може бути викликано потоком теплової енергії. A

— сучасні клітини живляться хімічною енергією, що дозволяє їм містити, підтримувати і репліціювати кодуючі інформацію полімери, що необхідно для дарвінівської еволюції. B

— потік теплової енергії через геологічні тріщини поблизу джерела тепла.

c — (1) температурний градієнт у межах тріщини міліметрового розміру індукує накопичення молекул за допомогою термофорезу і конвекції; (2) зовнішній потік приносить будівельні матеріали у відкриту пору; (3) експоненційна реплікація полегшується місцевою конвекцією, яка переносить молекули постійно між теплою і холодною зонами і, таким чином, викликає циклічну денатурацію нуклеотидів; (4) поєднання зовнішнього припливу, термофорезу і конвекції вибірково вловлює довгі молекули і вимиває короткі. Швидкість припливу визначає граничний розмір молекул в результаті відбору за їх довжиною. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemistry

За допомогою імітації шматка пористої породи з мережі крихітних скляних капілярних трубок, які нагрівали з одного боку, група німецьких вчених створила умови, в яких може бути досягнута стабільна реплікація довгих ланцюжків нуклеїнових кислот (головна передумова для виникнення життя на Землі) і подолані термодинамічні причини їх деградації. Вчені припускають, що на ранніх стадіях еволюції Землі такі умови могли виникати в потоці теплової енергії через пористі породи поблизу гідротермальних джерел.

Механізми реплікації нуклеїнових кислот займають центральне місце в теорії походження життя на Землі (див., наприклад, новина Створені рибозими, що синтезують дзеркальні копії самих себе, «Елементи», 03.11.2014). Згідно з цією теорією, функцію зберігання генетичної інформації і каталізу хімічних реакцій спочатку виконували комплекси молекул рібонуклеїнових кислот. В ході подальшої еволюції вони були замінені комплексами ДНК-РНК-білок, відокремленими від зовнішнього середовища мембраною. Під час первинної еволюції на Землі полімери нуклеїнових кислот повинні були поступово збільшуватися в розмірі, для того щоб вони змогли прийняти на себе функцію зберігання і відтворення інформації, яка необхідна для нормального функціонування живих організмів (див. новину Розмір геномів в ході еволюції життя на Землі збільшувався прискореними темпами, «Елементи», 19.10.2010). Наприклад, навіть найменший відомий у науці геном бактерії Carsonella (внутрішньоклітинний симбіонт комах листоблошок) налічує 159 662 пар підстав (див. новину Прочтен найменший геном, «Елементи», 16.10.2006), що в тисячі разів довше «геномів» рибозимів, які самореплікуються.

Однак ще наприкінці 1960-х експерименти зі штучної еволюції нуклеїнових кислот in vitro (у пробірці) показали, що генетична інформація з довгих молекул нуклеїнових кислот швидко втрачається. Відбувається це тому, що для самовідтворення коротких молекул полімерів потрібно менше матеріалу. Швидкість їх синтезу набагато вища, і це призводить до того, що короткі молекули поступово витісняють з реакційного середовища більш довгі молекули генетичних полімерів. Більш того, якщо мутації в процесі реплікації можуть змінити довжину послідовності нуклеїнового полімеру, то «виживання» тільки коротких послідовностей — практично неминучий еволюційний фінал.

Так, Шпігельман з колегами у своїх класичних дослідженнях ввели РНК, виділену з простого бактеріофагу Qв, в реакційну суміш, яка містила фермент реплікації РНК того ж вірусу Qв (так звана РНК-залежна РНК полімеразу, або РНК-репліказу) і матеріал для побудови нових РНК — одиночні клеотиди. У цьому середовищі запустився процес синтезу нових молекул-копій вірусної РНК. Через деякий час з вихідного розчину невелика частина синтезованої РНК була перенесена в пробірку зі свіжою реакційною сумішшю. Цей процес регулярно повторювали (див. D. Kacian et al., 1972. A Replicating RNA Molecule Suitable for a Detailed Analysis of Extracellular Evolution and Replication).

В результаті через 74 циклу подібних переносів оригінальний ланцюг, що складався з 4500 нуклеотидних підстав, трансформувався в карликовий геном, що містив всього 218 підстав. Отриманий таким чином Шпігельманівський монстр був здатний до дуже швидкого розмноження. Пізніше, 1997 року, було показано, що під час подальшої еволюції монстр Шпігельмана стає ще коротшим. Його «геном» редукується всього до 48 або 54 нуклеотидів, які просто є місцями зв’язування ферменту РНК-реплікази (F. Oehlenschläger, M. Eigen, 1997. 30 Years Later — a New Approach to Sol Spiegelman’s and Leslie Orgel’s in vitro EVOLUTIONARY STUDIES Dedicated to Leslie Orgel on the occasion of his 70th birthday).

Отже, виникає абсолютно закономірне питання: яким же чином в ході ранніх стадій земної еволюції мимовільно протікаючий процес редукції спадкового матеріалу міг би бути подоланий? Якраз на нього і спробували відповісти німецькі вчені з Центру нанонауки Мюнхенського університету Людвіга-Максиміліана. Вони припустили, що досить прості фізичні процеси, які лежать в основі моделі виживання більш довгих молекул (рис. 1), можуть зустрічатися в природних умовах в пористих гірських породах поблизу гідротермальних джерел.

Перш за все, необхідний тепловий потік через невеликі пори, який створює всередині пір температурний градієнт. Зовнішній потік приносить у відкриту пору молекули полімерів різної довжини. Підігрів з одного боку пори злегка зменшує щільність рідини, вона починає підніматися по цій стороні. Молекули полімерів ростуть, отримуючи будівельний матеріал із зовнішнього потоку, переміщуються в результаті дифузії до більш холодної частини пори і там осаджуються більш холодним спадним потоком рідини (рух молекул із зони з більш високою температурою в зону з більш низькою називають термофорезом). У підсумку, через різницю температур, виникає мікроциркуляція води, яка і утримує більш довгі молекули полімерів, а більш короткі молекули вимиваються з пори. Автори зазначають також, що місцева конвекція, яка переносить молекули постійно між теплою і холодною зонами, викликає їх циклічну денатурацію. Денатурація ДНК полягає в розплітанні і поділі ланцюгів (без розриву ковалентних зв’язків), що сприяє реплікації молекул полімерів. Таким чином, поєднання зовнішнього припливу, термофорезу і конвекції вибірково вловлює довгі молекули і вимиває короткі, а загальна швидкість зовнішнього припливу визначає граничний розмір молекул, які будуть «виживати» в даних умовах.

Щоб перевірити цю гіпотезу, Браун і його колеги створили імітацію шматка пористої породи з мережі крихітних скляних капілярних трубок, які нагрівали з однієї зі сторін. Вони виконали цілу серію дослідів, в яких окремо досліджували накопичення молекул в капілярах і фракціонування молекул в тепловому фільтрі (рис. 2).

Ріс. 2. «Тепловий фільтр», що відбирає нитки за довжиною

. Відкриття асиметрично підігріваної пори запускає постійний висхідний «харчовий» потік. Маркер довжин двцепочкових молекул ДНК (від 20 до 200 пар нуклеотидів з кроком 20 пар нуклеотидів), був введений в капіляр-пастку для оцінки довжини ланцюгів уловлюваних молекул. Подальша промивка капіляра чистим буфером з постійною швидкістю (v_s = 6 мікрометрів на секунду) продемонструвала порогову властивість фільтра — ланцюжки менше або рівні 80 пар нуклеотидів вимивалися з пори, в той час як більш довгі ланцюжки утримувалися внутрішньо.b

. Несиметрична структура потоку створюється накладанням висхідного потоку і конвекції. Термофорез штовхає довгі ланцюжки в низхідний потік і захоплює їх: накопичує довші молекули внизу низхідного потоку. Короткі ланцюжки піддаються впливу загального висхідного потоку і залишають пору. Захоплення ланцюжків фільтром є функцією швидкості загального «харчового» потока.

c. Швидкість зовнішнього потоку v_s регулює поділ нуклеїнових кислот (у порі залишаються більш довгі молекули). Як і в експерименті (a), маркер довжин двланцюжкових молекул ДНК був спочатку введений при малій швидкості потоку, яку потім послідовно збільшували. Вивільнені з теплового фільтру ДНК вимірювали з використанням гель-електрофореза.d

. Утримані фільтром фракції ДНК, отримані з електрофорезного гелю, складають ландшафт відбору (у двомірному просторі факторів: швидкість потоку — розмір молекули) на користь довгих олігонуклеотидів у цьому термальному середовищі проживання. Залежна від швидкості захоплювана фракція (тобто молекули певної довжини: чим вища швидкість потоку, тим більш важка фракція затримується в порі) описується моделлю динаміки в рідині. Лінії розкиду відображають співвідношення сигнал/шум зображень гелю.

Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemistry

І звичайно ж, вони вивчали дію відбору в створених ними умовах в популяції молекул, що реплікуються (рис. 3). В останньому експерименті в розчин вводили термостабільну ДНК-полімеразу (див. також Taq polymerase). В експериментах вони використовували не фрагменти РНК, а фрагменти ДНК. Фрагменти ДНК набагато простіше отримати в лабораторних умовах, а процеси взаємодії молекул ДНК і РНК з середовищем дуже схожі.

Ріс. 3. Відбір у популяції молекул ДНК, що реплікуються, населяють термальні місця розташування

. Молекули ДНК схильні до температурних коливань, які обумовлені спільним впливом термофорезу, конвекції, «харчового» потоку і дифузії. Моделювання випадкових траєкторій молекул продемонструвало, що ланцюжки завдовжки 75 пар підстав циркулюють у системі в середньому 18 хвилин. Ланцюжки довжиною 36 пар підстав через їх підвищену дифузію демонструють більш швидку циркуляцію, але вимиваються з системи після п’яти хвилин

. Термостабільна ДНК-полімераза бере участь у реплікації дволіпочкових молекул ДНК довжиною 80 пар підстав у процесі температурної конвекційної циркуляції. Кількісні вимірювання ДНК, пофарбовані флуоресцентним барвником (SYBR Green I), демонструють експоненціальну реплікацію з часом подвоєння 102 секунди.c

. Відкрита пора (див. рис. 1c) була заселена популяцією, що складається з двох типів нуклеїнових кислот (36 і 75 пар підстав). Кількісний електрофорез у гелі показав стійку реплікацію (збереження в середовищі протягом 7 годин, до кінця експерименту) тільки довших молекул. Коротші ланцюжки знижували чисельність і потім зникали (вимивалися з реакційного середовища), всупереч їх більш швидкій реплікації (меншому часу подвоєння числа молекул)

.d. Відносні концентрації двох конкуруючих видів всередині термальних розташувань. Тиск відбору, викликаний термальним градієнтом, змінює протягом часу структуру популяції, що складається з двох типів молекул (жовті прямокутники), відповідно до аналітичної моделі реплікації. Значення абсолютної пристосованості 1,03 і 0,87 для більш довгих і більш коротких ланцюжків відповідно. Без температурного градієнта коротші нуклеотиди виграють у довших молекул (сині гуртки), аналогічно до даних експериментів Шпігельмана. Лінії розкиду відображають співвідношення сигнал/шум зображень гелю

. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemistry

Як тільки дослідники почали проводити експерименти, вони тут же виявили, що більш довгі ланцюжки ДНК частіше зберігалися в капілярах, ніж більш короткі (рис. 2). У результаті більш довгі ланцюжки полімерів відтворювалися набагато краще всередині пори і їх число збільшувалося, в той час як більш короткі послідовності скоротили «чисельність» настільки, що в результаті вони вимерли (рис. 3).

Таким чином, Брауну і його колегам вдалося підібрати такі експериментальні умови, в яких стабільно зберігалися ланцюжки нуклеїнових кислот довше монстра Шпігельмана приблизно в 4 рази. Більш того, так як швидкість припливу визначає граничний розмір збережених в капілярах молекул, то принципово можливо підібрати такі умови, при яких будуть «виживати» ще більш довгі молекули полімерів.

Іншою цікавою особливістю проведеного експерименту був процес «розселення» полімерів. Коли реплікація і захоплення молекул всередині пори досягають стійкого стану, то знову репліковані молекули залишають пастку-пору разом з «кормовим» потоком. Це забезпечує ефективну передачу генетичних полімерів у сусідні системи пір.

Автори публікації відзначають, що якщо в представлену систему ввести процес мутування, то такі експерименти надають захоплюючу можливість вивчати механізми дарвінівської еволюції, які могли б протікати серед населення молекул в температурних градієнтах ранньої Землі.

Джерело: Moritz Kreysing, Lorenz Keil, Simon Lanzmich & Dieter Braun. Heatflux across an open pore enables the continuous replication and selection of oligonucleotides towards increasing length // Nature Chemistry. Published online 26 January 2015. Doi:10.1038/nchem.2155.

Див. також:

1) D. L. Kacian, D. R. Mills, F. R. Kramer, and S. Spiegelman. A Replicating RNA Molecule Suitable for a Detailed Analysis of Extracellular Evolution and Replication // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1972. V. 69(10). P. 3038–3042. Doi:10.1073/pnas.69.10.3038.

2) Frank Oehlenschläger, Manfred Eigen. 30 Years Later — a New Approach to Sol Spiegelman’s and Leslie Orgel’s in vitro EVOLUTIONARY STUDIES Dedicated to Leslie Orgel on the occasion of his 70th birthday // Origins of Life and Evolution of Biospheres. 1997. V. 27. Issue 5–6. P. 437–457. Doi:10.1023/A:1006501326129.

Володимир Гриньков