Трильйони беззвучних годинників

Постійна зміна дня і ночі — характерна риса земного буття. Добовий ритм чергування світла і темряви впливає на фізіологію і поведінку всього живого на землі. Більшість живих істот, у тому числі і людина, мають молекулярні «хронометри», синхронізовані зі світловим днем. Свій добовий молекулярний годинник є у бактерії і квітки, по цих годинах здійснюється обмін речовин у будь-якій клітині людського організму. І найдивовижніше, що механізм роботи таких годин у всіх живих організмах практично однаковий.

Земля. Занурення в сон (комп’ютерне зображення з сайту www.nasa.gov)

Французький астроном Жан-Жак де Меран (1678-1771) став родоначальником науки про добові ритми

Все живе на Землі підкоряється добовому ритму сну і пильнування. Винятки не становлять навіть рослини. Листки подорожника вдень приймають горизонтальне положення, а вночі складаються на зразок парасольки. При повному сонячному освітленні квітки одуванчика стають жовтими і пухнастими, в темряві ж щільно змикають пелюстки. Довгий час вважалося, що добовий ритм життєдіяльності залежить тільки від зовнішніх факторів, а саме від освітленості.

У 1729 році французький астроном Жан-Жак де Меран зацікавився геліотропами (від греч.helios «сонце», tropos «поворот») — рослинами сімейства бурачникових, які повертають суцвіття слідом за сонцем і опускають своє листя на ніч. На свій подив, де Меран виявив, що геліотропи продовжують піднімати і опускати листя в повній темряві. Але далі спостереження вчений не пішов, не зробивши жодних висновків зі свого досвіду.

Добовий ритм рослин цікавив і Чарльза Дарвіна. Він винайшов апарат для вимірювання руху листя. Дарвін характеризував стан рослини зі згорнутим листям як сон і припускав, що рослини складають листя на ніч, щоб зберегти тепло і вологу. На сторінці з книги Ч. Дарвіна «Здатність до руху у рослин» зображена Cassia corimbosa вдень і вночі

Експерименти де Мерана продовжив тридцять років потому його співвітчизник ботанік Анрі-Луї Дюамель. Він помістив горщик з геліотропом у темний льох. Увечері і вранці вчений відвідував свого вихованця і заставав квітку або «сплячим», або «пильнуючим» з розгорнутими листочками. Більш того, вчений поставив квітку в темну скриню і для підтримки постійної температури щільно накрив її ковдрами. Але ніщо не допомогло — квітка продовжувала дотримуватися режиму сну і пильнування. Дюамель прийшов до сміливого висновку: «Рух листя рослин не залежить від світла і тепла». Тоді від чого ж?

Через сто років за справу взявся великий швейцарський ботанік Огюстен Пірам Декандоль. Вдень і вночі шість яскравих ліхтарів висвітлювали мімозу, але та продовжувала складати листя на ніч і розправляти їх з ранку. Коли Декандоль почав висвітлювати листя тільки ночами, мімоза перейшла на новий ритм — вдень спала, а вночі пильнувала. Потім, правда, вона повернулася до колишніх звичок.

Вивід однозначний: добовий ритм рослин є якась внутрішня властивість, притаманна їм незалежно від світлового дня. Але пройшло ще довге століття, поки не було доведено, що «внутрішній хронометр» є і у тварин, в тому числі у людини.

Відомий американський нейрофізіолог Н. Клейтман проводить моніторинг сну свого асистента Б. Річардсона під час експериментальної самоізоляції в Мамонтовій печері (штат Кентуккі, США). 1938 рік

У 1938 році знаменитий американський нейрофізіолог Натаніель Клейтман і студент Чиказького університету Брюс Річардсон провели 32 дні в Мамонтовій печері (штат Кентуккі). Намагаючись переключитися на 28-годинний добовий цикл, вони хотіли довести, що добовий ритм людини — не притаманна організму властивість, а реакція на навколишній світ. Але до однозначного висновку сміливі експериментатори дійти не змогли: молодий організм студента перебудувався на новий цикл, а ось сорокарічному Клейтману це не вдалося. Крім того, дослідники не врахували, що будь-який світловий сигнал, а не тільки сонячне світло, може служити, кажучи науковою мовою, цайтгебером (нім. Zeitgeber — пристрій, що задає час).

У 1962 році німецький фізіолог Юрген Ашофф провів дослідження на своїх синах у підземному світло- і звуконепроникному бункері. Випробовуваним дозволялося вмикати і вимикати світло згідно з їх внутрішнім ритмом. Ашофф записував цикли сна-бадьорювання, температуру тіла, об’єм сечі та інші фізіологічні та поведінкові показники. Досліди Ашоффа довели: існує «вбудований хронометр», що дозволяє нам прокидатися без будильника, що падають на обличчя променів сонця або бадьорить аромату звареної кави.

З експерименту Ашоффа був зроблений ще один дуже важливий висновок: внутрішній час людини йде повільніше реального — він запізнюється приблизно на годину. Такий вроджений ритм називається циркадним (лат. circa dies — близько доби). Внутрішні циркадні ритми рослин становлять 23-28 годин, а тварин — 23-25 годин. Під впливом світлового дня циркадні ритми перетворюються на 24-годинні добові цикли. Циркадні ритми виявлені у всіх представників тваринного царства і на всіх рівнях організації.

Ліворуч: добовим ритмом ссавців управляє скупчення нейронів — супрахіазматичне ядро, що знаходиться в гіпоталамусі. Праворуч: внутрішні годинники під впливом світлового сигналу, який супрахіазматичне ядро перетворює на сигнал гормональний, можуть перекладатися «вперед» або «назад». Так організм підлаштовується під зміну часового поясу після авіаперельоту

У 1972 році американським дослідникам Роберту Муру і Віктору Ейхлеру вдалося показати, що циркадним ритмом ссавців управляє супрахіазматичне ядро (СХЯ), розташоване в головному мозку в основі гіпоталамусу (див. «Наука і життя» № 1, 2005). СХЯ людини являє собою сукупність близько 20 тисяч нейронів і налаштовується за допомогою зовнішніх сигналів, в основному денного світла. СХЯ обробляє інформацію про довжину світлового дня і посилає сигнал в орган проміжного мозку — епіфіз, де секретується гормон сну — мелатонін. Але гіпоталамус реагує на зовнішні сигнали, а звідки ж береться внутрішній добовий ритм?

Вгорі: Рон Конопка (ліворуч) і Сеймур Бензер, які відкрили 1971 року годинниковий ген періодичності Per, дають інтерв’ю в Каліфорнійському технологічному інституті, 2000 рік. Внизу: Локалізація гена Per на генетичній карті дрозофіли

Перші докази генетичної природи циркадних ритмів були знайдені в 1971 році в експериментах з плодовою мушкою Drozophila malanogaster, які проводили Рон Конопка і Сеймур Бензер з Каліфорнійського технологічного інституту. Нормальна плодова мушка має 24-годинний ритм добової активності. Конопка виявив, що в одних мушок цей ритм зміщено в бік зменшення (до 19 годин), а в інших — у бік збільшення (до 29 годин). Також в популяції були зовсім «неправильні» — аритмічні дрозофіли, у яких періоди сну і бадьорювання чергувалися випадковим чином. За допомогою техніки картування генів (gene mapping) всі три різні мутації були виявлені на одній і тій же ділянці Х-хромосоми, який потім отримав назву Period або Per. Тобто всі відхилення мушок від правильної циркадної поведінки обумовлені різними дефектами гена Per! Це був перший у світі годинниковий ген, який став відомий вченим. Після його клонування вдалося синтезувати білкову молекулу, за виробництво якої відповідає ген Per. Білок назвали PER (прописними літерами, щоб відрізнити від відповідного йому гена).

Подальші дослідження показали, що Per активний в основному в зорових клітинах дрозофіли, що не дивно. Виявилося, що білок PER проявляє циклічність: його максимальна концентрація реєструється в клітинному ядрі (тобто там, де проходить синтез білка) пізньої ночі. Відповідна йому мРНК — молекула, що передає інформацію від гена Per рибосоме, на якій відбувається синтез білка PER, теж пульсує в добовому ритмі, але пік її концентрації припадає на 6 годин раніше, ніж у білкової молекули PER. Це і зрозуміло — спочатку активується ген, потім синтезується мРНК, а через деякий час в ядрах клітини починає напрацьовуватися білок.

Через кілька років після епохального відкриття Конопки у плодової мушки був виявлений ще один годинниковий ген, названий Timeless (безчасний), скорочено — Tim. Причому для збереження нормальної добової активності мушкам необхідні і Tim і Per одночасно. Ще один годинниковий ген — Frequency (частота), або Frq, був виявлений у нейроспори — різновиду міцеліальних грибів, іноді званих «червоною хлібною цвіллю». Прийшла черга відкриттів генетичних «годинників» у ссавців.

Можна «позначити» годинниковий ген геном люциферази (ферменту зі світлячків, що генерує біолюмінесценцію), а потім за допомогою біолюмінесцентного аналізу побачити циркадну пульсацію будь-якого органу і тканини. На знімку: добова осциляція гена Per в легких миші

На початку 1990-х років група дослідників з Національного центру біологічного часу (Північно-Західний університет, штат Іллінойс, США) під керівництвом Джозефа Такахаші вперше ідентифікувала мишачий годинниковий ген Clock. Але означає це слово зовсім не «годинник», як можна було б подумати, воно являє собою абревіатуру від circadian locomotor output cycles kaput, що можна з натяжкою перекласти як «циркадний переривач циклів рухової активності». У той час ще не була відпрацьована техніка нокауту (див. «Наука і життя» № 12, 2007) — отримання тварин з «вибитим» геном. Тому маленька, на п «ять сторінок, стаття в журналі» Science «за 1994 рік була квінтесенцією праці величезної лабораторії протягом декількох років!

Ось коротка суть цієї роботи, яку варто викласти, хоча б для того, щоб зрозуміти ціну отриманого висновку: «… був виявлений ген, мутації в якому подовжують добовий цикл і скасовують його періодичність». У своїх дослідах американські дослідники використовували N-етил-N-нітрозілмочевину (ЕНМ) — речовину, що взаємодіє з молекулою ДНК і викликає випадкові мутації. Самцям миші вводили ЕНМ, після чого в деяких сперматозоїдах виникали мутації. Потім мутантних самців схрещували зі звичайними, немутантними, самками. Народилося гетерозіготне потомство — тисячі і тисячі мишей. Цих мишей поміщали в «біличчі» колеса і знімали діаграми активності при чергуванні світла і темряви і в повній темряві. У всіх мишей середнє значення циркадного ритму становило 23,7 години (стандартне відхилення 0,17 години).

Цікаво, що не всі істоти на Землі підкоряються сонячному циклу. Так, наприклад, рухова активність краба відповідає ритму припливів і відливів, цикл яких становить 12,4 години, що обумовлено тяжінням Місяця. А маленький вабливий краб (на фото) демонструє як добовий, так і приливний ритм: фарбування краба змінюється по сонячному циклу, а норки він риє — по місячному. Причому свій режим манний краб зберігає навіть в акваріумі, де ніяких припливів не буває і в помині

Несподівано виявили самця, чий добовий цикл склав 24,8 години. Тепер потрібно було зрозуміти, чи дійсно у нього є дефект в якомусь годинниковому гені. Цього гомозіготного самця (+ +) схрестили з трьома звичайними гомозіготними самицями (—). Отримали гетерозіготних (+ -) мишей потомства, цих мишей схрестили між собою, а потім знову протестували їх потомство на рухову активність. Так вдалося вивести гомозіготну (+ +) лінію чорних мутантних мишей з довгим циркадним циклом, які в повній темряві ставали «аритмічними». Тепер треба було визначити локалізацію мутантного гена, що викликає ці зміни в добовому ритмі життєдіяльності миші.

На той час була відома генетична карта всіх хромосом миші і хромосомні маркери-мітки (ділянки хромосом), що визначають якісь зовнішні фенотипічні особливості цієї лінії мишей. Наявність або відсутність генетичної мітки у нащадків «мічених» мишей легко визначалося «на око». Якщо маркер при схрещуванні втрачається, відбувається втрата відповідної зовнішньої ознаки. Група Такахаші провела генетичне картування годинникового гена і визначила його місце розташування на хромосомі. Для цього чорних «аритмічних» мишей кілька разів схрещували з білими мишами, ділянки хромосом яких були позначені маркерами. Коли при схрещуванні зникають відразу дві ознаки, це означає, що у потомства відсутня ділянка хромосоми, що містить відразу два маркери. Так вдалося визначити локалізацію відсутньої генетичної ділянки і, отже, місце розташування нового годинникового гена Clock, що відповідає за стійкість циркадного ритму миші.

Сьогодні, коли геном миші розшифрований повністю, визначити нуклеотидну послідовність відрізка ДНК між маркерами досить легко. Але 15 років тому, коли проводилося це дослідження, вченим доводилося секвенувати ділянки ДНК, що містять годинникові гени, самостійно.

Генрік Остер керує науковою групою, що вивчає циркадні ритми тварин, в Інституті біофізичної хімії Макса Планка (Німеччина)

П’ятнадцять років тому робота з визначення одного мутантного гена займала кілька років. Тепер з’явився новий потужний інструмент досліджень — стало можливим «вимкнути» який-небудь ген миші і подивитися, як це відбивається на її поведінці. Для визначення одного годинникового гена потрібно «всього» 1-2 роки роботи кількох дослідників. З кінця 1990-х років було відкрито ціле сімейство годинникових генів ссавців: ген Bmal, що працює в парі з геном Per, гени Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 та деякі інші.

Отже, гени, які контролюють добову активність живої клітини, відомі. А яким чином працює цей молекулярний хронометр? Розповідає один з відомих фахівців у галузі вивчення молекулярного механізму циркадної активності, керівник групи циркадних ритмів Інституту біофізичної хімії Макса Планка в Геттінгені (Німеччина) Хенрік Остер:

«Останнім часом стало відомо, що з невеликими варіаціями» внутрішньоклітинний хронометр «працює однаковим чином у всіх вивчених клітинах, включаючи нейрони СХЯ. Внутрішні «годинники» є не тільки в клітинах живих істот, але і в клітинних культурах, які вирощуються в лабораторії.

Молекулярний циркадний годинник являє собою цикл активації годинникових генів, яка поступово послаблюється через механізм зворотного зв’язку. Білки-активатори BMAL1 і CLOCK зв’язуються з регуляторною ділянкою ДНК (E-box), при цьому «включаються в роботу» годинникові гени Per і Cry (Cryptochrome). Це відбувається рано вранці. Через 2 години після активації годинникових генів у клітці спостерігається пік концентрації відповідних мРНК, а до полудня напрацьовується максимальна кількість білків PER і CRY.

Схема циклічної активації годинникових генів Per і Cry в клітці. Такий молекулярний хронометр працює за принципом «негативного зворотного зв’язку» у всіх живих клітинах на Землі: білковий комплекс активує гени, які запускають виробництво інших білкових молекул, що блокують активність цього комплексу

Діаграма добової активності (актограма) людини за відсутності зовнішніх сигналів — цайтгеберів (період сну показаний суцільною лінією). Як тільки людина опиняється в темряві та ізоляції (в даному випадку на 22-й день експерименту), її годинник перестає підлаштовуватися під схід сонця. Тоді виявляється власний внутрішній циркадний ритм людини, яка трохи більше 24 годин. Періоди сну і пильнування набувають характеру вільної течії і щодня зсуваються

Ці білкові молекули спочатку накопичуються в клітинній цитоплазмі, а в нічний період поступово повертаються в ядро і гасять активність білків BMAL1 і CLOCK, утворюючи з ними міцний комплекс, що призводить до блокування генів Per і Cry. Потім білки PER і CRY поступово розпадаються, і молекули BMAL1 і CLOCK вивільняються, щоб почати новий добовий цикл в клітці — включити годинникові гени Per і Cry. Сумарна тривалість такого циклічного процесу становить близько 24 годин.

У подібному молекулярному циклі задіяні й інші відомі годинникові гени. Більш того, 8-10% всіх активних (не тільки годинникових) генів осцилюють в добовому ритмі. Наприклад, у печінці процеси гліколізу, метаболізму жирних кислот, глюконеогенез відбуваються з періодичністю 24 години.

Крім того, за останніми даними, СХЯ у відповідь на світловий сигнал — цайтгебер посилає якісь невідомі хімічні сигнали, які активують вироблення кортиколіберину, а той у свою чергу — гіпофізарного адренокортикотропного гормону (АКТГ). Концентрація АКТГ у крові коливається циклічно, досягаючи максимуму о 6-8 годині ранку. Як відомо, АКТГ дуже важливий для організму, він стимулює синтез глюкокортикоїдів (кортизолу, альдостерону та ін.) в корі надниркових, виконує й інші регуляторні функції. Годинникові гени керують фізіологією надниркових, циклічним викидом адреналіну.

Сигнальні шляхи, що беруть участь у передачі тимчасової інформації з центрального координуючого органу — гіпоталамуса — в інші місця, задіяні в механізмі осциляцій всіх органів, поки мало вивчені. Це — предмет досліджень нашої групи «.

***

Організм людини складається з десятка трильйонів клітин, а значить, з трильйонів беззвучних біологічних годин, які відраховують час незалежно від світлового дня. За їх ходом невсипуще спостерігає скупчення мозкових клітин — десь на рівні переносиці — 20 тисяч нейронів СХЯ. Вони відповідають за те, щоб усі години в органах і клітинах включалися в роботу за світловим сигналом — вчасно і чітко. Для синхронізації годинників організму в крові присутні спеціальні речовини, про які поки ми знаємо дуже мало. Але скоро дізнаємося, без сумніву.

Автор висловлює подяку Хенріку Остеру за обстоятельное

интервью і люб’язно надані ілюстрації.