Вельмишановний мікроб

Всього сто років тому мікробів, що живуть в людському кишечнику, вважали нахлібниками і шкідниками. В останні роки людську мікробіоту стали називати своєрідним органом нашого тіла, необхідним для нормальної життєдіяльності організму.

З часів Пастера відомо, що шлунково-кишковий тракт людини — це, по суті, біореактор проточного типу, в якому мешкає безліч мікроорганізмів. Ставлення вчених до мікрофлори кишечника за цей час радикально змінилося. Років сто тому великий Ілля Мечников, основоположник сучасної теорії імунітету, за створення якої він отримав Нобелівську премію (на двох зі своїм непримиренним опонентом, не менш великим Паулем Ерліхом), пропонував навіть видалення товстого кишечника як один із способів продовження життя. А тим, кому цей захід здавався занадто радикальним, рекомендував пити якомога більше кефіру, щоб витіснити шкідливих, на його думку, мікробів корисними лактобактеріями. Через півстоліття курс змінився на 180 градусів. Виявилося, що нормальна мікрофлора кишківника, а також шкіри і слизових оболонок виконує безліч корисних функцій — наприклад, пригнічує життєдіяльність постійно атакуючих організм патогенних мікроорганізмів. А в останні роки найсміливіші з мікробіологів пішли ще далі, оголосивши людину і її мікробів єдиним симбіотичним надорганізмом.

Розвиток методів молекулярної біології вивів учених на новий рівень розуміння процесів симбіозу людини і її мікрофлори, які здавалися добре вивченими і від подальшого вивчення яких не чекали особливих сюрпризів. Стрімке зростання швидкості і падіння вартості методів секвенування ДНК (визначення її нуклеотидної послідовності) і паралельне зростання потужності персональних комп’ютерів і розвиток інтернету дали можливість аналізувати інформацію про великі ділянки геномів. Після того як були розшифровані хромосоми сотень видів окремих бактерій, у генетиці мікроорганізмів з’явився новий підхід — популяційний: аналіз генів відразу всіх бактерій, що населяють певний ареал. Зрозуміло, населення «людського біореактора» виявилося однією з найбільш важливих для вивчення мікробних популяцій.

Перша робота, яка змусила абсолютно по-новому поглянути на кишкову мікробіоту, була опублікована в 1999 році групою вчених з Національного інституту агрономічних досліджень (Франція) і Університету Рідінга (Великобританія). Автори вирішили застосувати для дослідження мікробної популяції кишечника метод секвенування генів 16S РНК (див. врізку).

16S PHK — посвідчення особи бактерії

Перший етап визначення мікроорганізмів — їх культивування на поживних середовищах. Але ряд мікробів не бажають рости ні на одній з середовищ

Сучасні метод

Вивчати раніше недоступні некультивовані бактерії і почати наводити порядок в донезмоги заплутаній систематиці вже відомих прокаріот стало можливим з розвитком біоінформатики і появою сучасних методів молекулярної біології — ПЛР, що дозволяє з однієї ділянки ДНК отримати мільярди точних копій, клонування виділених генів в бактеріальних плазмідах і методик секвеніювання. Ідеальним маркером для ідентифікації мікроорганізмів виявився ген, який кодує 16S рибосомальну РНК (кожна з двох суб’єдиниць рибосом — клітинних майстерень з синтезу білка — складається з переплетених молекул білків і ланцюжків рибонуклеїнових кислот).

Ідеальний маркерний Цей ген

є в геномі всіх відомих бактерій і архей, але відсутній у еукаріот і вірусів, і якщо ви знайшли характерну для нього послідовність нуклеотидів — ви точно маєте справу з генами прокаріот. Цей ген має як консервативні ділянки, однакові у всіх прокаріот, так і видоспецифічні. Консервативні ділянки служать для першого етапу полімеразної ланцюгової реакції — приєднання досліджуваної ДНК до праймерів (затравочних ділянок ДНК, до яких вивчається ланцюжок нуклеотидів повинен приєднатися для початку аналізу решти послідовності), а видоспецифічні — для визначення видів. Ступінь схожості видоспецифічних ділянок відображає еволюційне споріднення різних видів. Для клонування і подальшого аналізу можна використовувати саму рибосомальну РНК, яка в будь-якій клітині присутня в більшій кількості, ніж відповідний їй ген. Нуклеотидні послідовності 16S РНК всіх відомих бактерій і архей загальнодоступні. Виявлені послідовності порівнюють з наявними в базах даних і ідентифікують вид бактерії або оголошують її належною до некультивованого вигляду.

Нова систематика Останнім

часом йде інтенсивний перегляд старої, фенотипічної класифікації бактерій, заснованої на погано формалізованих критеріях — від зовнішнього вигляду колоній до харчових уподобань і здатності фарбуватися різними барвниками. Нова систематика спирається на молекулярні критерії (16S РНК) і тільки частково повторює фенотипічну.

Що у нас всередині

Кодуючі послідовності 16S РНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПлЦР) витягували безпосередньо з «навколишнього середовища» — 125 мг людського, вибачте, стільця вбудовували в плазміди кишкової палички (не тому, що вона кишкова, а тому, що Escherichia coli — одна з улюблених робочих конячок молекулярних біологів) і знову виділяли з розмов’язних біологів. Таким чином була створена бібліотека генів 16S РНК всіх мікроорганізмів, що знаходилися в зразку. Після цього випадковим чином було відібрано і секвеновано 284 клони. Виявилося, що тільки 24% отриманих послідовностей 16S РНК належали відомим раніше мікроорганізмам. Три чверті мікрофлори в кишечнику кожної людини більше сотні років уникали уваги дослідників, озброєних методами класичної мікробіології! Вчені просто не могли підібрати умови для культивування цих бактерій, тому що найбільш примхливі мешканці кишечника відмовлялися рости на традиційних мікробіологічних середовищах.

На сьогоднішній день за допомогою молекулярних методів встановлено, що в мікробіоті дорослої людини представлені 10 з 70 великих бактеріальних таксонів. Близько 90% наших мікробів належать до типів Firmicutes (до них належать, наприклад, всім відомі лактобактерії — основні «винуватці» скисання молока) і Bacteroidetes — облігатні анаероби (організми, здатні жити тільки за відсутності кисню), які часто використовуються як індикатор забруднення природних вод каналізаційними стоками. Решта 10% популяції поділені між таксонами Proteobacteria (до них відноситься, серед інших, і кишкова паличка), Actinobacteria (з одного з видів актиноміцетів був виділений антибіотик стрептоміцин), Fusobacteria (звичайні мешканці ротової порожнини і часта причина пародонтозу), Verrucomicrobia (нещодавно в геотермальному джерелі був виявлений вид цих мікробів, що харчуються метаном, якого в кишечнику предостатньо завдяки життєдіяльності інших мікроорганізмів), Cyanobacteria (їх досі часто називають по-старому — «синьо-зеленими водоростями»), Spirochaetes (на щастя, не бліді), Synergistes і VadinBE97 (що це за звірі, запитайте у творців нової систематики прокаріот).

Мікробного в нас більше, ніж людського

Крім вивчення окремих видів кишкової мікрофлори, в останні роки багато дослідників вивчають бактеріальний метагеном — сукупність генів усіх мікроорганізмів у пробі вмісту людського кишечника (або, наприклад, у змиві зі шкіри, або в пробі мулу з морського дна).

Для цієї мети використовують найбільш автоматизовані, комп’ютеризовані та високопродуктивні технології секвенування ДНК, дають можливість аналізувати короткі послідовності нуклеотидів, збирати головоломку за кількома «літерами», що збігаються на кінцях цих ділянок, багаторазово повторювати цю процедуру для кожного шматочка геному і отримувати розшифровку окремих генів і хромосом зі швидкістю до 14 мільйонів нуклеотидів на годину — на порядки швидше, ніж це робилося всього кілька років тому. Так, було встановлено, що мікробіота кишечника налічує приблизно 100 трильйонів бактеріальних клітин — приблизно в десять разів більше, ніж загальна кількість клітин людського тіла.

Набір генів, що входять до складу бактеріального метагеному, приблизно в сотню разів перевищує набір генів людського організму. Якщо говорити про обсяг біохімічних реакцій, що протікають всередині мікробної популяції, він знову ж таки багаторазово перевищує обсяг біохімічних реакцій в організмі людини.

Бактеріальний «реактор» реалізує в організмі господаря метаболічні ланцюжки, які той не здатний підтримувати сам — наприклад, синтез вітамінів і їхніх попередників, розкладання деяких токсинів, розкладання целюлози до засвоюваних полісахаридів (у жуйних тварин) тощо.

Від немовляти до старості

Незважаючи на те що видовий склад мікроорганізмів кишечника досить одноманітний, кількісне співвідношення представників певних систематичних груп у мікробіоті різних людей може сильно варіювати. Але що ж являє собою нормальна кишкова мікрофлора і які шляхи її формування?

На це питання було дано відповідь в опублікованій у 2007 році роботі групи американських біологів під керівництвом Патріка Брауна зі Стенфордського університету. Вони простежили формування мікробіоти у 14 новонароджених немовлят протягом першого року життя. Авторам вдалося встановити кілька джерел колонізації шлунково-кишкового тракту. Мікробіота немовлят мала схожість з мікрофлорою матері: вагінальної, фекальної або з мікрофлорою зразків грудного молока. Залежно від джерел колонізації, в мікрофлорі кишечника немовлят протягом першого року життя переважали різні види. Ці відмінності залишалися значними протягом усього періоду дослідження, проте до однорічного віку ставали помітні риси формування дорослої мікробіоти. Цікаві дані були отримані на прикладі пари близнюків. Мікрофлора у них була практично ідентичною за складом і змінювалася теж однаково. Ця знахідка виявила величезну роль людської складової пари «мікробіота-господар» у формуванні популяції кишкової мікрофлори. Для чистоти експерименту, звичайно, слід було б розлучити немовлят ще в пологовому будинку (до речі, прекрасний сюжет для індійського фільму! Через роки близнюки дізнаються один одного за аналізами мікрофлори…). Але дані інших робіт підтвердили припущення, що індивідуальні, в тому числі спадково обумовлені, особливості біохімії людини мають великий вплив на склад її мікробіоти.

Худі й товсті

Дослідження, проведені в лабораторії Джефрі Гордона (Школа медицини при Університеті Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі), дозволили пов’язати видове розмаїття бактерій шлунково-кишкового тракту з дієтою та особливостями обміну речовин індивідууму. Результати експерименту опубліковані в грудневому номері журналу Nature за 2006 рік. Річний експеримент передбачав встановити кореляцію між надлишком ваги у людини і складом мікробної популяції її кишечника. Дюжину товстунів, які погодилися покласти свої животи на вівтар науки, розділили на дві групи. Одна сіла на дієту з низьким вмістом жирів, друга — з низьким вмістом вуглеводів. Всі добровольці худіли, і одночасно у них змінювалося співвідношення двох основних груп мікроорганізмів кишечника: кількість клітин Firmicutes знижувалася, а кількість Bacteroidetes, навпаки, зростала. На знежиреній дієті така зміна ставала помітною пізніше — після того, як пацієнти втрачали 6% ваги, а на низьковуглеводній — після втрати перших кілограмів (2% вихідної маси тіла). При цьому зміна складу мікрофлори була тим більше виражена, чим менше ставала вага учасників експерименту.

Боротьба з ожирінням

Результати подальшого вивчення вченими змін симбіотичного мишино-мікробного організму (див. врізку «Перевірено на мишах») блискуче підтвердили гіпотезу про те, що мікробіота тучних індивідуумів сприяє більш глибокій переробці їжі. Порівняння зразків ДНК стільця тучних і нормальних мишей показало, що мікробіом хмар насичений генами ферментів, що дозволяють більш ефективно розкладати полісахариди. Кишківник реальних мишей містив більшу кількість кінцевих продуктів ферментації — сполук оцтової і масляної кислот, що вказує на більш глибоку переробку компонентів їжі. Калориметричний (від слова «калорії»!) аналіз зразків мишиного стільця підтвердив це: стілець ob/ob-мишей містив меншу кількість калорій, ніж у мишей дикого типу, які не так повно засвоювали енергію з їжі.

Крім важливої інформації про «мікробну» складову ожиріння авторам вдалося показати принципову схожість мікрофлор страждаючих ожирінням людей і мишей, що відкриває нові перспективи в дослідженні проблеми надмірної ваги, а можливо, і вирішення цієї проблеми шляхом «пересадки» здорової мікрофлори або її формування у пацієнтів, які страждають ожирінням.

Перевірено на мишах

Паралельно в тій же лабораторії Джефрі Гордона проводилися експерименти на лабораторних мишах, що несуть мутацію в гені лептину — «гормону ситості», білка, який синтезується в клітинах жирової тканини і вкладає свою лепту у формування почуття насичення. Миші, у яких пошкоджено обидві копії цього гена (ця мутація позначається індексом Lepob), їдять на 70% більше, ніж дикий тип, з усіма витікаючими з цього наслідками. А вміст Firmicutes в їх кишківнику в півтора рази вище, ніж у гетерозіготних ліній з тільки однією бракованою алеллю (ob/+) і гомозіготних за нормальним геном ліній дикого типу (+/+). Вплив мікрофлори на обмін речовин її «господаря» дослідники перевірили на ще одній моделі — гнотобіотичних мишах. Таких тварин, які з моменту народження живуть у стерильних камерах і жодного разу в житті не зустрічалися з жодним мікробом, використовують у біомедичних дослідженнях нечасто. Абсолютна стерильність у мишатнику, крольчатнику і тим більше козячому хліву — справа дорога і клопітка, а після зустрічі з першим же мікробом або вірусом бідолахи або помруть, або стануть непридатними до подальших експериментів. Що відбувається у гнотобіотів з імунною системою — окрема історія, а їдять вони за трьох і при цьому — шкіра та кістки через відсутність мікробного компонента травлення. Після пересадки мікрофлори від хмарчних (ob/ob) донорів миші-гнотобіоти за два тижні розтовстіли майже в півтора рази (на 47%). Ті, яких «засіяли» мікрофлорою від донорів дикого типу (+/+) з нормальною вагою, поправилися тільки на 27%.

І з виснаженням

Те, що мікробіота може керувати метаболізмом господаря, вже не викликає сумніву. Дослідження лабораторії Гордона, присвячені проблемі зайвої ваги, дозволили перекинути місток до лікування метаболічних захворювань. Серед них такі види загального виснаження, що вражають дітей від року до чотирьох років в бідних країнах з тропічним кліматом, як маразмус (до маразму це слово має лише лінгвістичне відношення: греч. marasmoz дослівно означає виснаження, згасання) і квашіоркор (мовою одного з племен Гани kwashiorkor — «червоний хлопчик»). Виникнення захворювань пов’язують з нестачею білків і вітамінів при переході від грудного вигодовування на дорослу їжу. Але захворювання вибірково вражають дітей, чиї брати і сестри не відчували ніяких проблем з переходом на традиційний для даного регіону раціон. Дослідження показали, що кишкова мікрофлора хворих дітей разюче відрізняється від мікрофлори їхніх батьків, а також від мікрофлори здорових братів і сестер. Насамперед відзначалася практично повна відсутність у кишковій популяції Bacteroidetes і домінування рідкісних видів, що відносяться до типів Proteobacteria і Fusobacteria. Після того як хворих дітей (акуратно, щоб не передозувати!) відгодовували посилено-білковою їжею, їх мікробіота ставала схожою на нормальну, таку, як у родичів, з переважанням Bacteroidetes і Firmicutes.

Дослідження останніх років не тільки докорінно змінили сформовані уявлення про кишкову мікрофлору людини, але і сприяли появі концепції, що розглядає мікробіоту кишечника як додатковий багатоклітинний «орган» людини. Орган, що складається з різних ліній клітин, здатних спілкуватися як між собою, так і з організмом господаря. Орган, що перерозподіляє енергетичні потоки, здійснює важливі фізіологічні реакції, змінюється під впливом середовища і самовідновлюється при змінах, викликаних зовнішніми умовами. Продовження дослідження «бактеріального органу» може і повинно призвести до розуміння законів його функціонування, розкриття його тонких зв’язків з організмом господаря і, як наслідок, до виникнення нових методів боротьби з хворобами людини шляхом цілеспрямованого лікування дисфункцій обох складових метаорганізму.