Відбір сперматозоїдів впливає на пристосованість потомства у даніо-реріо

Ріс. 1. Самець (внизу) і самка даніо-реріо (Danio rerio). Зображення з блогу Американського генетичного товариства genestogenomes.org

Шведські біологи показали, що у рибок даніо-реріо сперматозоїди з різною тривалістю активності з однієї порції сперми по-різному впливають на пристосованість отримуваного потомства. Ікринки, запліднені довгоживучими сперматозоїдами, рідше гинули за першу добу, а виросли з них риби мали підвищену пристосованість: самці ефективніше запліднювали самок, а самки породжували більш життєздатне потомство. Між сперматозоїдами з різною тривалістю життя були виявлені генетичні відмінності, які можуть відповідати за виявлений феномен. Раніше вважалося, що ефект такого відбору статевих клітин у тварин мінімальний.

Життєвий цикл більшості багатоклітинних тварин складається з двох фаз, що різняться числом хромосом у клітинах. У гаплоїдній фазі клітини несуть одиночний набір хромосом, а в диплоїдній — подвійний, зазвичай утворений при злитті гаплоїдних статевих клітин батьків. Власне, гаплоїдна фаза представлена у тварин саме статевими клітинами (сперматозоїдами і яйцеклітинами). У рослин же фаза з одиночним набором хромосом складається з багатьох (принаймні, з декількох) клітин: наприклад, до неї відносяться заростки папороті та пилкові зерна насіннєвих рослин. А у мхів гаплоїдна фаза навіть переважає над диплоїдною: подвійним набором хромосом у них міститься тільки в спорангієносцях і спорангіях.

Через те, що гаплоїдна фаза у тварин одноклітинна, вона не розглядається в якості окремого організму. При цьому якщо всі клітини диплоїдного організму з невеликими припущеннями можна вважати такими, що володіють ідентичним генотипом, то різні гамети (статеві клітини) однієї і тієї ж особи, мають різну ДНК: під час редукційного поділу — мейозу з двох копій кожного гена в гамету випадковим чином потрапляє тільки одна. При цьому вважається, що у тварин природний відбір відбувається тільки на диплоїдній стадії, а фенотипічні властивості сперматозоїдів визначаються швидше диплоїдним геномом батька, який породив їх, а не їхньою власною ДНК (див., наприклад, S. Pitnick et al., 2009. Sperm length is not influenced by haploid gene expression in the flies Drosophila melanogaster and Scathophaga stercoraria), і не впливають на властивості потомства.

Втім, останнім часом з’являються роботи, що оскаржують це положення: було показано, що у асцидії Styela plicata більш довгоживучі сперматозоїди породжують потомство з більш високою виживаністю на ранніх стадіях (A. J. Crean et al., 2012. Fertilization is not a new beginning: The relationship between sperm longevity and offspring performance), а в атлантичного лосося Salmo salar сперматозоїди із середньою тривалістю активності породжують мальків, які раніше вилуплюються з ікринок (S. Immler et al., 2014. Sperm variation within a single ejaculate affects offspring development in Atlantic salmon). Однак досі не було робіт, в яких вчені намагалися б відокремити вплив старіння сперматозоїдів від їх спадкових (генетичних або епігенетичних) особливостей, а також оцінити більш довгостроковий вплив різноякісності сперматозоїдів всередині одного еякулята (порцію сперми, що виділяється самцем під час одного семяїзверження) на пристосованість потомства і тим самим зрозуміти, чи можливий природний відбір на гаплідній стадії.

Нова стаття дослідницької групи Сімони Іммлер (Simone Immler) з Уппсальського університету, опублікована в журналі PNAS, заповнила цю прогалину. Вчені працювали з рибами даніо-реріо (Danio rerio, стандартний модельний організм у біологічних дослідженнях) і показали, що в одному еякуляті співіснують різноякісні когорти сперматозоїдів, які розрізняються за ефектами на пристосованість потомства.

У цього виду, як і у багатьох риб, запліднення зовнішнє — ікра (яйцеклітини) і молоки (сперма) вимітуються у воду, де і відбувається їхня зустріч. Таке запліднення можна провести і «в пробірці». Оскільки сперматозоїди і яйцеклітини даніо-реріо активуються при контакті з водою, то, випускаючи сперму до ікринків в різний час, її легко можна розділити на коротко- і довгоживучу. Вчені виконали це, розділивши сперму на дві когорти: у першій (яку позначали абревіатурою SAT — short activation time) сперматозоїдам відразу ж давали можливість запліднити ікру, у другій (LAT — long activation time) ікру до сперматозоїдів додавали тільки після того, як 50% з них втрачали рухливість. Для кожного, хто бере участь в експерименті самця, цей момент виявлявся шляхом прямого спостереження під мікроскопом. При цьому виявилося, що у різних самців половина сперматозоїдів втрачала рухливість приблизно за один і той же час — 25 секунд, тому дослідники повторили досліди за спрощеним протоколом: когорту LAT становила сперма віком 25 секунд після активації. Щоб зрівняти ймовірність запліднення, у випадку LAT на ту ж кількість ікри брали в два рази більше сперми. Крім того, щоб виключити можливий вплив ефекту старіння яйцеклітин в обох варіантах досвіду використовували свіжу ікру, зібрану не більше ніж за хвилину до зустрічі зі сперматозоїдами.

Результати дослідів з різним способом відбору гамет (які за часткою зберегли активність гамет і за часом після активації) виявилися узгоджені: мальки, породжені «довгограючими» сперматозоїдами, відрізнялися підвищеною виживаністю в першу добу, а дорослі самці, які виросли з них, володіли спермою, більш багатою сперматозоїдами, які, в свою чергу, були швидше, ніж у їх братів, породжених SAT-спермою (рис. 2). Крім того, через 8 годин після запліднення SAT-спермою в більш ніж 80% ікринок були виявлені апоптичні клітини (апоптоз — запрограмована клітинна смерть) проти 50% у LAT-сперми.

Ріс 2. Вплив сперми з когорт SAT (сині мітки) і LAT (рожеві мітки) на властивості потомства. На графіках А, С і Е LAT-сперма відбиралася першим способом (за часткою вцілілих сперматозоїдів), на графіках B і D — другим способом (за часом після активації). А — частка вцілілих ембріонів через 24 і 144 години після запліднення. В — частка вцілілих ембріонів через 24 години після запліднення. З і D — швидкість сперматозоїдів (у мкм/с), горизонтально вказано час після активації сперми (у секундах). E — щільність сперми (число сперматозоїдів на мікролітр). Графіки з обговорюваної статті в PNAS

Оскільки два методи поділу сперми показали узгоджені результати, подальші досліди проводили по більш простому у виконанні протоколу з поділом сперми за часом після активації.

Дослідники оцінили репродуктивний успіх самців і самок, породжених двома варіантами сперми, при спарюванні з рибами, які не брали участі в експерименті. У дочок експериментальних риб не було виявлено жодного значущого ефекту ні в числі вимітаних яйцеклітин, ні в успішності запліднення. Однак у синів відмінності були: у самців, породжених LAT-спермою, успішність запліднення була вище на 4%, а самки вимітували на 20% більше ікринок (рис. 3, графіки А і В)! Останній результат може здатися дивним, однак у даніо-реріо самки мечуть ікру у відповідь на вимітування молок самцями і можуть регулювати її кількість у відповідь на «продуктивність» самця. У LAT-самок все-таки виявилася деяка перевага: їх потомство краще виживало, у самців же відмінностей між варіантами досвіду виявлено не було (рис. 3, С). Ну і нарешті, самці і самки, породжені LAT-спермою, залишали більше нормально розвиваються яєць порівняно з рибками, породженими SAT-спермою (рис. 3, D). Таким чином, різні варіанти сперматозоїдів впливають на пристосованість і в другому поколінні, проте ці ефекти проявляються в основному тільки у самців. Можливо, це пояснює причину збереження в популяції цієї мінливості.

Ріс. 3. Показники успішності розмноження і якісності потомства, породженого когортами SAT (сині мітки) і LAT (рожеві мітки), при схрещуванні з рибами, які не брали участь в експерименті: частка запліднених ікринок (А); кількість відкладених при спарюванні ікринок (В); частка ембріонів, які вижили через 24 години після запліднення (С); частка нормальних ембріонів (D). Зафарбовані символи позначають самців, нефарбовані — самок. Графіки з обговорюваної статті в PNAS

Як вже було сказано вище, попередні дослідження, що вказували на різноякісність сперми всередині еякулята, не дозволяли відокремити вплив властивостей самих сперматозоїдів від їх старіння. Відомо, що з плином часу якість ДНК сперматозоїдів падає, в них накопичуються шкідливі мутації, крім того, їх властивості можуть змінюватися за рахунок епігенетичних механізмів — різних модифікацій ДНК (див. L. C. Lindeman, 2011. Prepatterning of developmental gene expression by modified histones before zygotic genome activation).

Щоб виключити цю можливу причину виявлених відмінностей, дослідники провели дві серії дослідів, що відсікали можливість старіння сперматозоїдів до і після еякуляції. У першому експерименті вони брали кілька (дві або три) послідовних порцій сперми у кількох самців — і ніякого ефекту прееякуляційного старіння (тобто зміни якості сперматозоїдів, поки вони чекали своєї черги) на життєздатність потомства виявлено не було. Щоб перевірити гіпотезу про можливе постеякуляційне старіння, вчені змінили концентрацію солей у воді, тим самим знизивши осмотичний стрес на клітини і продовживши їх час активності, а разом з тим і час дії факторів, що погіршують якість ДНК. У цьому експерименті не було виявлено відмінностей між виживаністю нащадків, породжених спермою, активованою за 25 і за 50 секунд до запліднення. Навівши доводи на користь того, що отримані результати не можуть бути пояснені старінням сперматозоїдів, автори додають, що взагалі-то в цьому випадку ефект мав би бути протилежним: потомство від пізніших гамет було б менш пристосованим.

Таким чином, на думку авторів обговорюваної роботи, їх експерименти дійсно дозволили розділити сперматозоїди всередині одного еякулята на дві групи, що розрізняються впливом на пристосованість потомства.

Можна запропонувати два можливих механізми того, як відбір за часом від активації до запліднення може розділяти сперматозоїди. Один з них полягає в тому, що в SAT-спермі і в LAT-спермі в заплідненні беруть участь різні когорти статевих клітин. Це може проістікати через негативний зв’язок між швидкістю руху сперматозоїдів, особливо важливою в організмів із зовнішнім заплідненням, і тривалістю їх активності — раніше це було показано на морських їжаках (див. D. R. Levitan, 2000. Sperm velocity and longevity trade off each other and influence fertilization in the sea urchin Lytechinus variegatus). У цьому випадку в SAT-спермі в заплідненні б брали участь швидкі і короткоживучі гамети, а в LAT-спермі — повільні і довгоживучі. Другий варіант полягає в тому, що поділ когорт неповний: у SAT-спермі в заплідненні беруть участь і короткоживучі, і довгоживучі гамети, в той час, як в LAT-спермі — тільки довгоживучі. Так як перший варіант був відкинутий на основі прямих спостережень швидкості і часу життя окремих сперматозоїдів у декількох самців (ці показники виявилися не пов’язані), то дослідники уклали, що працює другий варіант.

Причина відмінностей у пристосованості потомства, отриманого від різних когорт сперматозоїдів, може відбутися як у генетичних відмінностях між ними (за рахунок відмінностей у ДНК), так і в епігенетичних (ДНК однакові, але деякі ділянки модифіковані, наприклад, метильовані). Автори не досліджували можливі епігенетичні маркери, але надали довід на користь того, що відмінності між гаметами саме генетичні.

Як було зазначено вище, організми породжують гамети двох типів по тих локусах (ділянках ДНК), по яких вони гетерозіготні (тобто несуть різні варіанти гена на двох копіях хромосоми): у статеву клітку потрапить або один, або інший алель. Відповідно, відбір сперми може призводити до відмінності в частках деяких генних варіантів, якщо їхні носії-сперматозоїди будуть різнитися за часом активності. Щоб виявити можливі відмінності в алельному складі, треба було додатково відокремити коротко- і довгоживучі клітини. Щоб зробити це, вчені поміщали сперматозоїди в краплю води, від центру до країв якої зростала концентрація глюкози — відомо, що сперматозоїди рухаються в бік джерела цієї речовини. Далі вчені розділили сперматозоїди по тому, наскільки вони змогли просунутися за час своєї активності: оскільки всі вони рухалися від центру, в центральній частині краплі залишилися короткоживучі клітини, а на периферії — довгоживучі.

Також дослідники взяли проби ДНК з плавників (це стандартний метод взяття генетичних проб у риб) у самців — «донорів» сперми. Це дозволило виявити ті локуси, за якими вони гетерозіготні, а тому сперматозоїди можуть нести різні алелі. Крім того, в якості контролю використовували інтактну (не схильну до ніяких експериментальних маніпуляцій — в даному випадку відбору за часом активності) сперму тих же самців.

Порівняння з плавниками і з інтактною спермою не виявило можливого зміщення частот алелей, що відбувається при утворенні гамет (могло бути так, що деякі з них схильні потрапляти в сперматозоїди частіше, ніж просто випадково — так званий мейотичний дрейф) і при проведенні експерименту. Однак між довго- і короткоживучими сперматозоїдами виявилися значущі відмінності в частотах алелей. Втім, ці результати були отримані всього на трьох самцях і самі автори дуже обережні з висновками, підкреслюючи тільки сам факт відмінностей в генотипах різних когорт сперматозоїдів.

Продемонстрований в обговорюваній роботі феномен (що мають спадкову природу відмінності між сперматозоїдами в еякуляті одного і того ж самця впливають на пристосованість потомства) говорить про те, що у тварин також теоретично можливий гаплоїдний відбір (хоча автори не привели можливих механізмів його здійснення в природі). Останній добре відомий у рослин, у яких спостерігається конкуренція пилкових зерен за проростання на рильці пестика (конкурувати між собою можуть і зерна пилку однієї рослини), і еволюціоністи давно вивчають його роль у розвитку адаптацій і накопиченні вантажу шкідливих мутацій (див., наприклад, статті D. Charlesworth, B. Charlesworth, 1992. The effects of selection in the gametophyte stage on mutational load; H. A. Orr, S. P. Otto, 1994. Does diploidy increase the rate of adaptation?). Крім того, вважають автори, відбір гамет зможе знайти застосування і в технологіях екстракорпорального запліднення.

Джерело: Ghazal Alavioon, Cosima Hotzy, Khriezhanuo Nakhro, Sandra Rudolf, Douglas G. Scofield, Susanne Zajitschek, Alexei A. Maklakov, Simone Immler. Haploid selection within a single ejaculate increases offspring fitness // PNAS. 2017. V. 114. №30. P. 8053–8058. DOI: 10.1073/pnas.1705601114.

Сергій Лисенков