Виготовлена бактерія з синтетичним мінімальним геномом

Ріс. 1. Група бактерій JCVI-syn3.0 з синтетичним мінімальним геномом, що містить всього лише 473 гени — менше, ніж у будь-якого іншого організму, що розмножується самостійно. Змінний розмір клітин — одна з відмінних рис нового мікроба. Довжина масштабного відрізка — 200 нм. Фото з обговорюваної статті в Science

Співробітники інституту Крейга Вентера повідомили про новий успіх на шляху до створення штучних мікроорганізмів із заданими властивостями. Використовуючи розроблені раніше методи виготовлення синтетичних геномів і впровадження їх в бактеріальні клітини, дослідники створили життєздатну бактерію, геном якої містить всього лише 531 тисячу пар підстав і 473 гена — менше, ніж у будь-яких існуючих в природі мікробів, здатних до самостійного розмноження. В ході роботи стало ясно, що сучасні знання про влаштування клітини і функції генів все ще недостатні для проектування геномів з чистого аркуша, тому без методу проб і помилок обійтися поки не вдається. Функції 149 з 473 генів «мінімального геному» невідомі: експерименти показали, що ці гени необхідні для стійкого зростання бактерій, але що саме вони роблять, ще належить з’ясувати.

Крейг Вентер (John Craig Venter) і співробітники створеного ним інституту (J. Craig Venter Institute) зробили черговий важливий крок на шляху до своєї головної мети — створення штучних мікробів з бажаними властивостями.

До цієї мети Крейг Вентер і його колеги методично рухаються вже більше 20 років, починаючи з прочитання в 1995 генома бактерії Mycoplasma genitalium — організму, що володіє найменшим геномом з усіх живих істот, здатних до автономного розмноження (внутрішньоклітинні паразити та облігатні симбіонти на кшталт Nanoarchaeum не в рахунок, оскільки вони користуються для свого розмноження послугами чужої клітини, що потенційно дозволяє їм зменшувати свій геном хоч до нуля).

У M. genitalium в геномі всього 583 тисячі пар підстав (п. о.) і 525 генів. Однак ця бактерія розмножується за мікробіологічними мірками дуже повільно (подвоює свою чисельність за 16 годин), і експериментувати з нею незручно. Тому дослідники використовують як основний об’єкт іншу мікоплазму, Mycolasma mycoides. Її геном вдвічі більший, зате розмножується вона в 16 разів швидше.

Нове досягнення Крейга Вентера і його команди засноване на попередніх революційних проривах, про які розказано в новинах Перша в світі операція з пересадки геному дозволила перетворити один вид бактерій в інший («Елементи», 02.07.2007) і Створено першу живу істоту з синтетичним геномом («Елементи», 25.05.2010). В обговорюваній роботі за основу був узятий виготовлений раніше штам з синтетичним геномом M. mycoides JCVI-syn1.0 (скорочено syn1.0). Геном цієї бактерії містить 1 078 809 п. о. і майже не відрізняється від свого природного прототипу — геному диких M. mycoides, за винятком декількох «водяних знаків» — послідовностей, в яких вчені зашифрували нуклеотидним кодом свої імена і адреси. На думку Крейга Вентера, такі вставки робити необхідно, щоб синтетичних мікробів завжди можна було відрізнити від натуральних.

Ключовим етапом на шляху до проектованих організмів є виявлення мінімального набору генів, необхідного для життя клітини. Йдеться, звичайно, про життя в ідеальних лабораторних умовах, але все-таки про життя автономне, тобто без допомоги інших живих клітин. Давно відомо, що навіть у бактерій з дуже маленькими геномами, таких як M. genitalium, в ідеальних і незмінних умовах багато генів виявляються надлишковими. Отже, будь-який природний геном можна радикально скоротити. Вирішення цього завдання не тільки дасть майбутнім проектувальникам оптимальну відправну точку, а й дозволить краще розібратися в базових принципах роботи клітини. Саме цю мету і поставили перед собою автори обговорюваної статті.

На перший погляд завдання здається не таким вже складним, але це оманливе враження. Очевидний підхід до її вирішення — порівняти геноми безлічі різних мікробів і знайти гени, які є у всіх без винятку. На жаль, цей спосіб не працює: «мінімальний набір», який вдається виявити з його допомогою, складається приблизно з 250 генів і явно недостатній для життя клітини. Справа в тому, що багато важливих функцій можуть з успіхом виконуватися різними, несхожими один на одного генами. Тому в геномі кожного мікроба є гени, які не є надконсервативними (тобто відсутні у багатьох інших мікробів), але при цьому абсолютно необхідні. Як наслідок, щоб спроектувати мінімальний геном, потрібно або в точності знати функцію кожного гена і повний набір необхідних для життя функцій, або провести величезну експериментальну роботу з визначення мінімального набору генів методом проб і помилок.

Спочатку автори спробували піти першим шляхом і спроектувати мінімальний геном суто теоретично, сподівавшись, що наука вже накопичила достатньо знань про принципи роботи живої клітини і про функції генів. Розрахунок був, зокрема, на те, що погано вивчені гени не є життєво важливими.

Дослідники видалили з геномного тексту «синтетичної бактерії» syn1.0 все те, що здалося їм зайвим на основі знань, накопичених молекулярною біологією. Залишені були тільки гени з встановленими (і при цьому життєво важливими) функціями, а також ті, за якими були експериментальні дані, що свідчать про їх незамінність.

Спроектований таким способом «гіпотетичний мінімальний геном» був виготовлений з синтетичних олігонуклеотидів, зібраний воєдино і впроваджений в клітини мікоплазм за допомогою методів, описаних у новині Створено першу живу істоту з синтетичним геномом («Елементи», 25.05.2010). Але фокус не вдався: штучний геном не зміг забезпечити виживання клітин. Розділивши його на вісім рівних частин і перевіривши кожну окремо (в комбінації з 7/8 вихідного геному syn1.0), автори виявили, що тільки один з восьми фрагментів був спроектований без фатальних помилок, та й у ньому теж щось не так, тому що клітини з цим фрагментом хоч і не гинули, але росли дуже повільно.

Невдача змусила авторів переглянути свою думку про ступінь розвитку сучасних біологічних знань і вдатися до старого доброго методу проб і помилок. Раз за разом вони синтезували геноми з тими чи іншими відредагованими фрагментами, вставляли їх у клітини і дивилися, що вийде. На щастя, методи, розроблені для виготовлення syn1.0 і згодом сильно поліпшені, поряд з удосконаленою методикою транспозонного мутагенезу (див.:Transposon mutagenesis), дозволили виконати цю роботу за найближчий час. Автори повідомляють, що зараз на весь виробничий цикл від комп’ютерного проекту до готового синтетичного геному йде менше трьох тижнів: майже в 100 разів менше, ніж пішло на створення першого синтетичного геному, робота над яким завершилася в 2008 році.

Замість спроб грубо поділити гени syn1.0 на «необхідні» і «надлишкові» автори розробили більш тонку класифікацію, що відображає той факт, що крім абсолютно необхідних для життя генів існує чимало таких, без яких на перший погляд можна обійтися, проте їх видалення уповільнює зростання клітин, а якщо видалити відразу кілька таких «квазі-необхідних» (quasi-essential) генів, клітина може взагалі загинути.

Вісім вісімок геному, спроектовані заново з урахуванням цієї обставини, виявилися сумісними з життям кожна окремо (тобто в комбінації з іншими сімома восьмими вихідного геному syn1.0), але всі разом вони знову виявилися нежиттєздатними. Цього разу причина була в тому, що деякі необхідні функції виконуються двома взаємозамінними генами, розташованими в різних вісімках. В ході індивідуальної перевірки кожен з цих генів був класифікований як «надлишковий», тому що з його функцією успішно справлявся другий ген. Однак одночасне видалення обох генів виявилося фатальним. Щоб вичистити ці помилки, вченим довелося довго вивчати методом транспозонного мутагенезу проміжні штами, у яких кілька фрагментів геному було відредаговано, а інші збережені у вихідному вигляді. Виловлювалися гени невідредагованих частин, які у таких штамів стали незамінними, хоча не були такими у syn1.0. У підсумку вдалося скласти список пар генів, з яких можна видалити один, але не обидва.

Коли ці та багато інших труднощів були нарешті подолані, на світ з’явився синтетичний мікроб syn3.0 (назва syn2.0 дісталася одному з проміжних результатів роботи) — володар самого маленького геному з усіх клітинних форм життя, здатних до автономного розмноження. Його геном — найкраще на сьогоднішній день наближення до ідеалу «мінімального геному» (рис. 2).

Ріс. 2. Ліворуч — технологія виготовлення мінімального геному: цикл «Дизайн — Збірка — Тестування» (Design — Build — Test). Геномні тексти проектуються на комп’ютері (Design), потім виготовляються синтетичні короткі фрагменти — олігонуклеотиди (Synthesis), з яких за допомогою складного багатоступеневого процесу збирається цілий геном (Construction). Цей геном розмножується в дріжджових клітинах (Cloning), виділяється в чистому вигляді (Isolation) і додається в культуру клітин Mycoplasma capricolum, деякі з яких заковтують ці геноми (Transplantation), а потім діляться, передаючи частини своїх нащадків тільки синтетичний геном. Залишається перевірити, чи будуть такі нащадки життєздатними і оцінити швидкість їх розмноження (Outgrowth). Праворуч — вихідний геном syn1.0 (зовнішнє кільце) і виготовлений на його основі мінімальний геном syn3.0 (внутрішнє кільце). Зображення з обговорюваної статті в Science

Геном syn3.0 істотно менше, ніж у колишнього рекордсмена M. genitalium: він містить 531 490 п. о., 438 білок-кодуючих генів і 35 генів функціональних РНК. При цьому syn3.0 розмножується впятеро швидше, ніж M. genitalium (але все ж втричі повільніше, ніж syn1.0), подвоюючи свою чисельність за три години. Автори могли б прибрати ще кілька «квазі-необхідних» генів, пожертвувавши швидкістю зростання, але вирішили цього не робити, щоб не ускладнювати собі подальшу роботу.

Що ж являє собою отриманий «мінімальний геном»? З 901 гена syn1.0 була видалена майже половина (428). Серед віддалених переважають гени білків з невідомими функціями, гени ліпопротеїнів, мобільні елементи, а також гени, пов’язані з тими аспектами метаболізму, які не потрібні для життя в лабораторному живильному середовищі, що містить всі необхідні бактеріям малі молекули. Наприклад, оскільки в цьому середовищі багато глюкози, більшість генів, пов’язаних з транспортом і метаболізмом інших цукрів, вдалося безболісно прибрати, залишивши тільки гени, необхідні для поглинання і засвоєння глюкози.

Серед генів, що залишилися у syn3.0, переважають гени, пов’язані зі збереженням, розмноженням і зчитуванням генетичної інформації (репарація, реплікація, транскрипція, трансляція), з клітинним поділом, а також гени мембранних білків. Оскільки syn3.0 не здатна синтезувати амінокислоти, нуклеотиди, вітаміни та інші малі молекули, вона повинна отримувати все це з середовища, а для цього потрібні транспортні білки, локалізовані в клітинній мембрані.

Найцікавіше, що про функції значної частини генів syn3.0 мало що відомо. Для 65 генів з 473 функція невідома зовсім, а для 84 про неї можна тільки смутно здогадуватися за схожістю амінокислотних послідовностей з вивченими білками інших організмів. У багатьох з цих загадкових генів є родичі (теж з невідомою функцією) в геномах інших організмів — від архей до Homo sapiens. Мабуть, вони дійсно виконують в клітці якісь дуже важливі, але поки не розшифровані функції. Це показує, наскільки неповні наші знання про устрій живої клітини.

Зовнішній вигляд нових мікробів теж підніс сюрпризи (рис. 3). У рідкому середовищі бактерії syn3.0, на відміну від syn1.0, не плавають поодинці, а осідають на дно, де утворюють біоплівки з різноманітними структурами, то вибудовуючись акуратними рядами, то роздуваючись або зливаючись у великі бульбашки. Крім того, в скупченнях syn3.0 крім клітин звичайного розміру (0,5-1,0 мкм) присутні багато дрібниць, причому, мабуть, життєздатної (живі клітини, здатні утворювати нові колонії, проходять через фільтр з діаметром пор 0,2 мкм). Ймовірно, в процесі редагування геному дослідники видалили якісь гени, що забезпечують стійкість розвитку, стабілізують процес клітинного ділення або структуру мембран, що і призвело до зростання випадкової мінливості клітин. Автори повідомляють, що схожі фенотипи спостерігалися раніше у деяких мікоплазм при вирощуванні в нестандартних умовах, в яких могли змінитися процеси синтезу ліпідів і властивості мембран.

Ріс. 3. Зовнішній вигляд колоній syn1.0 і syn3.0. У рідкому середовищі клітини syn1.0 плавають окремо (вгорі зліва), тоді як syn3.0 осідають на дно (вгорі справа), де утворюють біоплівки з нитчастими багатоклітинними структурами (білі стрілки) і незрозумілими великими бульбашками (чорні стрілки). Для клітин syn3.0 також характерний великий діапазон мінливості за розміром (внизу). Довжини масштабних відрізків: 10 мкм (верхні фотографії) і 1 мкм (нижні фотографії). Зображення з обговорюваної статті в Science

Крейг Вентер і його колеги наостанок ще поекспериментували з геномом syn3.0, переставляючи гени з місця на місце (багато генів вдалося згрупувати за функціями, що повинно полегшити роботу майбутнім дизайнерам), замінюючи в генах кодони на синонімічні і вносячи однонуклеотидні заміни в життєво необхідні генрибосомних РНК. Все це не вплинуло на життєздатність штучного мікроба, який, отже, зберіг якийсь рівень генетичної пластичності і може бути підданий додатковій оптимізації.

Ця робота знаменує собою важливий рубіж у розвитку біотехнологій. Якщо перша бактерія з синтетичним геномом, syn1.0, по суті мало відрізнялася від природної бактерії Mycoplasma mycoides, збудника пневмонії корів, то про нового мікроба syn3.0 цього вже не скажеш. Від спадкової інформації M. mycoides залишилася тільки половина, гени переставлені, кодони змінені, фенотип клітин теж змінився. Мабуть, можна сказати, що syn3.0 — це не тільки володар самого маленького геному з усіх, хто самостійно розмножується живих істот, але й організм, який зазнав найбільш радикальної штучної генетичної модифікації. До того ж його геном був спочатку зібраний з хімічно синтезованих олігонулеотидів на основі комп’ютерного проекту. Розроблена авторами потужна система DBT (Design — Build — Test, рис. 2) використовувалася в даному випадку для виготовлення мікроба з мінімальним геномом, але ж її можна з тим же успіхом застосовувати для оптимізації бактерій за багатьма іншими (потенційно — мало не за будь-якими) параметрами. Схоже, людство дійсно стоїть на порозі ери цілеспрямованого проектування живих істот з бажаними властивостями.

Джерело: Clyde A. Hutchison III, Ray-Yuan Chuang, Vladimir N. Noskov, Nacyra Assad-Garcia, Thomas J. Deerinck, Mark H. Ellisman, John Gill, Krishna Kannan, Bogumil J. Karas, Li Ma, James F. Pelletier, Zhi-Qing Qi, R. Alexander Richter, Elizabeth A. Strychalski, Lijie Sun, Yo Suzuki, Billyana Tsvetanova, Kim S. Wise, Hamilton O. Smith, John I. Glass, Chuck Merryman, Daniel G. Gibson, J. Craig Venter. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. V. 351. DOI: 10.1126/science.aad6253.

Див. також:

1) Перша в світі операція з пересадки геному дозволила перетворити один вид бактерій на інший, «Елементи», 02.07.2007.

2) Створено першу живу істоту з синтетичним геномом, «Елементи», 25.05.2010.

3) Synthetic microbe has fewest genes, but many mysteries — популярний синопсис до обговорюваної статті.

Олександр Марков