«Зоопарк» інгібіторів динаміки мікротрубочок

Про авторів

Полімери білка тубуліну (мікротрубочки) разом з іншими елементами цитоскелета забезпечують безліч внутрішньоклітинних процесів. З одного боку, це майже «незламні» білкові нитки, які пронизують всю клітку і виконують роль «рейок» для внутрішньоклітинного транспорту, з іншого боку — дуже динамічні структури [1]. У лічені хвилини вони можуть вирости в довжину на десятки, а то й сотні мікрометрів і всього за кілька секунд — повністю розібратися. Причому фази росту і вкорочення спонтанно змінюють один одного. Ця унікальна властивість, звана динамічною нестабільністю, не виявляється у інших білків — актинових і проміжних філаментів, разом з якими мікротрубочки надають клітині механічну жорсткість, дозволяють рухатися і ділитися. У попередній статті було детально розглянуто будову мікротрубочки та її властивості, розібрано експериментальні та теоретичні підходи до вивчення цих особливих білкових ниток. Тепер же більше уваги приділимо різним речовинам, здатним кардинальним чином впливати на складну поведінку мікротрубочок. Ці різноманітні органічні молекули, багато з яких успішно використовуються в медицині, називаються інгібіторами тубуліну.

Ріс. 1. Будова мікротрубочки

Як правило, мікротрубочка складається з 13 більш тонких ниток так званих протофіламентів (рис. 1) [2]. Вони з’єднуються один з одним уздовж осі мікротрубочки, замикаючись в порожній циліндр. Протофіламенти побудовані з найбільш елементарних структурних одиниць — дімерів білка тубуліну. Вони називаються так, тому що складаються з двох частин — так званих — і лід-мономерів. На всіх перерахованих структурних рівнях організації мікротрубочки зв’язку між протофіламентами і дімерами можуть утворюватися і розриватися, що дозволяє їй рости або вкорачуватися. Як саме буде змінюватися довжина мікротрубочки, залежить від того, чи є на її кінці достатньо лід-мономерів, пов’язаних з молекулою гуанозинтрифосфату (ГТФ). Цей молекулануклеотид має безліч вкрай важливих функцій, серед яких, наприклад, входження в алфавіт генетичного коду в якості однієї з чотирьох букв; перенесення енергії в клітці, поряд з іншою схожою молекулою, АТФ, а також регуляція роботи різних ферментів. Молекули ГТФ впливають на властивості тубулінів, надаючи їм здатність полімеризуватися [3]. Разом з цими молекулами у своєму складі тубуліни приєднуються до кінця мікротрубочки. Згодом відбувається хімічна реакція, в результаті якої ГТФ перетворюються на гуанозиндифосфат (ГДФ). Якщо критична кількість молекул ГТФ перетворюється на ГДФ, кінець мікротрубочки починає розбиратися [4]. Важливо також зазначити, що обидва кінці не еквівалентні. Мікротрубочка має полярність: кінець, утворений лід-мономерами, прийнято називати «мінус» -концем, а представлений лід-мономерами — «плюс» -концем. «Мінус» -конець в клітці зазвичай закріплений в спеціальній структурі, званій центром організації мікротрубочок, в той час як «плюс» -конець звернений до кордону клітини і бере участь у безлічі процесів. Наприклад, уздовж мікротрубочки у напрямку до «плюс» — кінця або від нього можуть переміщатися різні «вантажі» за допомогою моторних білків. Під час ділення клітини саме «плюс» — кінці прикріплюються до хромосомів за допомогою інших допоміжних білків і здатні розвивати сили [5], необхідні для рознесення хромосом по двох дочірніх клітинах.

Однією з найуспішніших стратегій хіміотерапії пухлин є використання інгібіторів тубуліну для придушення ключової властивості мікротрубочок — динамічної нестабільності [6]. Це дозволяє зупинити поділ ракових клітин за рахунок порушення однієї з основних функцій мікротрубочок — поділу хромосом під час мітозу. Кожна з цих речовин по-своєму унікальна і володіє особливими характеристиками впливу на мікротрубочки. Не заплутатися в такій різноманітності допомагає класифікація інгібіторів тубуліну за двома основними параметрами: місце пов’язування з цим білком і характер впливу на динаміку всієї мікротрубочки. Ці інгібітори впливають на клітини подібним чином — призводять до загибелі [7, 8]. Але принаймні одна з причин того, що ракові клітини відносно більш чутливі до цих речовин порівняно з нормальними клітинами, полягає в тому, що багато ракових клітин діляться частіше, ніж нормальні клітини, і тому частіше проходять стадію вразливості для мітотичних отрут. Сам механізм, який запускає загибель клітини, криється в тому, що мікротрубочки не можуть правильно взаємодіяти з хромосомами і розносити їх по двох дочірніх клітинах. Це порушення негайно реєструється в контрольній точці освіти веретена поділу. У разі тривалих безуспішних спроб клітини виправити ситуацію запускається каскад з ферментативних реакцій для того, щоб вона акуратно вбила себе за допомогою одного з механізмів програмованої смерті — апоптозу [9, 10].

У численних роботах в даній області наголошується, що існує зв’язок між тим, в якому місці тубуліну приєднується інгібітор і як цей інгібітор впливає на динаміку мікротрубочки. За останніми експериментальними даними, для кардинальної зміни її динаміки достатньо всього декількох молекул (або навіть однієї молекули!).

Колхіцин — відомий старожил

Особливе місце в нашому «зоопарку» інгібіторів динаміки мікротрубочок займає речовина, з якою нерозривно пов’язана історія відкриття тубуліну, — колхіцин. Один час сам тубулін навіть називався колхіцин-зв’язуючим білком [11].

Рис, 2. Безвременник осінній (а), молекула колхіцину (б) і схема його взаємодії з «закрученими» дімерами тубуліну (в). Зображено кінець мікротрубочки з вигнутими протофіламентами і детальну будову фрагмента протофіламента на основі кристалічної структури комплексу з двох дімерів тубуліну, білка RB3-SLD і колхіцину [12]

Колхіцин відомий медицині з давніх пір. Вперше його виділили з рослини (рис. 2, а) безвременника осіннього (Colchicum autumnale) і використовували для лікування подагри. Властивості колхіцину як інгібітора тубуліну і речовини, що зупиняє клітинний поділ, стали відомі відносно недавно — на зорі вивчення тубуліну і одночасно з першими дослідженнями мікротрубочок. Відтоді інтерес до цієї невеликої молекули (рис. 2, б) не згасає, оскільки колхіцин має яскраво виражену здатність придушувати динамічну нестабільність мікротрубочок і ділення клітин, у тому числі ракових, причому в невеликих концентраціях (близько десятків або сотень наномоль/літр). Колхіцин міг би виявитися дуже корисним у хіміотерапії, якби не його надто висока токсичність. Ця обставина змушує шукати інші настільки ж ефективні, але менш токсичні інгібітори, а для цього необхідно зрозуміти, в чому полягає унікальний механізм впливу колхіцину на мікротрубочки.

Зараз, завдяки численним дослідженням в цій області, відповідь на дане питання вже близька. Це стало можливо завдяки отриманню кристалізованого комплексу, в якому тубулін пов’язаний з колхіном таким же чином, як це відбувається в розчині. Тут важливо нагадати, що в розчині дімір тубуліну має так звану «закручену» конформацію. Схожу форму дімерів вдається отримати за допомогою додаткових білків сімейства статмінів, які дозволяють їм утворити кристал. Його отримання необхідне для проведення рентгеноструктурного аналізу, що дозволяє здатність якого дозволяє розрізнити положення окремих атомів. У комплексі, що складається з тубуліну, пов «язаного з ним колхіцину і допоміжного білка RB3-SLD, присутні два дімери тубуліну, між якими існує один поздовжній зв» язок (рис. 2, в) [12]. Згідно з останніми експериментальними даними [13, 14], тубулін має аналогічну «закручену» конформацію не тільки, коли він вільний або пов «язаний з білком RB3-SLD у розчині, але й коли знаходиться на кінцях вигнутих протофіламентів мікротрубочок під час їх збирання та розбирання (див. рис. 2, в). У тілі мікротрубочки, тобто далеко від її кінців, дімери тубуліну володіють «прямою» конформацією. Дослідники порівняли становище кожного атома «закрученого» дімера тубуліна, пов «язаного з колхіном, з атомами» прямого «дімера тубуліна [12]. Виявилося, що, зв’язавшись з розчиненим тубуліном у «закрученій» конформації, колхіцин перешкоджає «випрямленню» цього дімера і, відповідно, його вбудовуванню в тіло мікротрубочки. Завдяки цьому факту, «кузен» колхіцину, інгібітор з сімейства колхіцин-подібних сполук під назвою аллоколхіцин, навіть допоміг показати, що обмін нуклеотидів (ГТФ на ГДФ) у складі тубуліну не супроводжується зміною ступеня його «закрученості». Для цього автори статті [15] скористалися унікальною властивістю аллколхіцину інтенсивно флуоресціювати в результаті зв’язування з «закрученим» дімером тубуліна і завдяки цьому зуміли визначити аффінність зв’язування. З’ясувалося, що, незалежно від того, який з нуклеотидів знаходиться в дімері, аффінність його пов’язування з аллоколхіцином однакова, тому можна вважати, що вільні дімери тубуліну володіють «закрученою» конформацією незалежно від нуклеотиду в своєму складі. Ця робота — яскравий приклад того, яку важливу роль займають інгібітори тубуліну не тільки в прикладному відношенні, але і у вирішенні фундаментальних проблем.

Таксол не перестає нас дивувати

Рис, 3. Плід тису коротколічного (а), молекула таксола (б) і схема зв’язування таксола з внутрішньою поверхнею мікротрубочки (в). Зображено тіло мікротрубочки; крупніше показані «прямі» дімери тубуліну з молекулами таксола на внутрішній поверхні мікротрубочки [21]

Хоча в чистому вигляді ця речовина отримана і досліджена не так давно, з нею вже пов’язана значна кількість несподіваних фактів. Робота про перше виділення таксола з кори тису коротколічного (Taxus brevifolia) з’явилася в 1967 р., і тоді ж описані властивості таксола як протипухлинного з’єднання (рис. 3, а, б) [16]. Через деякий час з’ясувався перший дивовижний факт, пов’язаний з тим, що таксол справляє значний стабілізуючий ефект на мікротрубочки [17]. Тоді це було несподіваним явищем, оскільки інші відомі в той час інгібітори, такі як колхіцин і вінбластин (про який йтиметься нижче), мають явну властивість руйнувати мікротрубочки при великих концентраціях. Таксол же, навпаки, сприяє зростанню мікротрубочки, причому цей ефект посилюється при збільшенні його концентрації.

Таксол добре зв’язується з самими мікротрубочками, прикріплюючись до дімерів тубуліну в їхньому складі, причому з вільним тубуліном в розчині він зв’язується погано (рис. 3, в) [18]. Якщо врахувати, що місце зв’язування таксола знаходиться на внутрішній поверхні мікротрубочки, тобто в її просвіті, варто задатися питанням — як таксол туди потрапляє зовні? Можна припустити, що таксол виявляється в просвіті мікротрубочки через її відкриті кінці і за рахунок дифузії розподіляється по внутрішній поверхні. Однак він взаємодіє з мікротрубочкою так швидко, що така дифузія не змогла б це забезпечити [19]. Можливо, таксол проникає всередину мікротрубочки якимось чином прямо через її стінку, але як саме це відбувається, поки невідомо. Крім того, нещодавно було виявлено чергову дивовижну властивість таксола: молекули цієї речовини якимось чином можуть впливати на притаманну мікротрубочці властивість спонтанно змінювати фази росту і вкорочення [20]. Виявляється, всього кілька молекул таксола здатні збільшити частоту перемикань фази вкорочення на фазу зростання. Цей результат проливає світло на таємничі властивості таксола стабілізувати мікротрубочку і сприяти її зростанню.

Незважаючи на велику кількість фундаментальних проблем, пов’язаних з механізмом взаємодії таксола і мікротрубочки, ця речовина широко використовується в прикладних цілях. Крім дуже успішного застосування таксола в хіміотерапії, його, як і колхіцин, часто використовують для вивчення самих мікротрубочок або, наприклад, їх взаємодії з іншими білками [22].

Дволикий вінбластин

Рис, 4. Квітка барвінку рожевого (а), молекула вінбластину (б) і схема взаємодії вінбластину з кінцем мікротрубочки (в). Зображено кінець мікротрубочки з вигнутими протофіламентами і детальну будову фрагмента протофіламента на основі кристалічної структури комплексу з двох дімерів тубуліну, білка RB3-SLD і вінбластину [29]. Видно близьке розташування молекули вінбластину і нуклеотиду в складі лід-мономеру

З цією речовиною пов’язані багато успіхів хіміотерапії з тих пір, коли виявилася його властивість зупиняти клітинний поділ. Це сталося 60 років тому і описано у двох роботах, в яких вперше вивчено на той момент нову протипухлинну речовину вінбластин [23, 24]. Вперше його виділили з вічнозеленої багаторічної трав’янистої рослини (рис. 4, а) — барвінок рожевий (Catharanthus roseus). Згодом у клінічну практику були введені і багато інших аналогічних речовин, що зв’язуються з тубуліном в тому ж місці, що і вінбластин. До них належать, наприклад, віндезин, вінкристин, винорілбін і вінфлунин.

Вінбластин може зв’язуватися не тільки з розчиненим тубуліном, але і з самими мікротрубочками, при цьому він приєднується переважно до їхнього кінця [25]. Місце його зв’язування розташовується між димерами тубуліну поблизу молекули ГТФ (рис. 4, в) [26]. У концентраціях близько декількох мікромоль/літр вінбластин сприяє деполімеризації мікротрубочок і руйнує веретено ділення. Як не парадоксально, але при дуже малих концентраціях (близько декількох наномоль/літр) вінбластину, навпаки, складається ситуація, коли мікротрубочка не зростає і не вкорачується [27]. Така «стабілізація» нагадує ефект, що чиниться таксолом, але, як вважається, в її основі лежить інший механізм [28]. Таким чином, вінбластин, залежно від його концентрації, можна розглядати як стабілізатор, так і дестабілізатор мікротрубочок.

Детальний механізм впливу вінбластину досі неясний. З одного боку, він (як колхіцин) може перешкоджати утворенню зв’язків між дімерами в тілі мікротрубочки, з іншого, — сприяти (подібно таксолу) утворенню поздовжніх зв’язків між дімерами тубуліну [25]. Нарешті, близькість вінбластину до нуклеотиду ГТФ гіпотетично могла б дозволити йому впливати на швидкість перетворення цього нуклеотиду в ГДФ в результаті гідролізу. Оскільки прийнято вважати, що гідроліз ГТФ у складі дімера тубуліну відіграє ключову роль у стабільності мікротрубочки, у вінбластину є ще один можливий механізм впливу на динамічну нестабільність мікротрубочки.

Малі концентрації, але сильні ефекти!

Ми вже згадували, що інгібітори тубуліну колхіцин, таксол і вінбластин можуть чинити значний ефект на динаміку всієї мікротрубочки (аж до її повного придушення), присутня в розчині навіть в концентраціях менше 1 мкМ. Спробуємо уявити собі механізм впливу, наприклад, колхіцину. Нехай він полягає в тому, що, зв’язавшись з розчиненим тубуліном, колхіцин не дозволяє йому брати участь у зростанні мікротрубочки. Цей простий і зрозумілий механізм інгібування характерний для білка RB3-SLD. Він допомагає отримати кристалічну структуру тубуліну, зв’язуючи разом два дімери. Відомо, що додавання RB3-SLD в концентрації 4 мкМ до розчину вільного тубуліну з концентрацією 20 мкМ призводить до того, що характер зростання мікротрубочок відповідає випадку, коли в розчині тільки 12 мкМ тубуліну [30]. Показано, що відсутні 8 мкМ вільного тубуліну пов’язані білком RB3-SLD, причому на одну молекулу білка, як і слід було очікувати, доводиться два дімери тубуліну. Але у випадку з колхіном та іншими інгібіторами справа йде не так просто. Якби колхіцин діяв так само, то ми б прийшли до очевидного протиріччя. Дійсно, швидкість зростання мікротрубочки лінійно збільшується при підвищенні концентрації вільного тубуліну (рис. 5). Причому характерні значення концентрації вільного тубуліну в розчині — мікромолярні — на два порядку більше тих концентрацій, в яких колхіцин може значно впливати на динаміку всієї мікротрубочки. Припустимо, що концентрація вільного тубуліну 10 мкМ, а концентрація колхіцину 400 нМ. Добре відомо, що в таких умовах майже весь вільний колхіцин може зв’язатися з розчиненим тубуліном, причому на один дімер тубуліну буде припадати одна молекула колхіцину. Концентрація тубуліну, пов’язаного з колхіцином, в даному розчині буде приблизно дорівнює початковій концентрації колхіцину.

Рис, 5. Залежність швидкості росту «плюс» -конця мікротрубочки від концентрації вільного тубуліну (точки — експеримент [31], лінія — апроксимація)

У такому випадку концентрація тубуліну, що бере участь у зростанні мікротрубочки, впаде на 400 нМ, тобто всього на 4%. Поглянувши на рис. 5, можна зрозуміти, що така незначна зміна в концентрації вільного тубуліну майже ніяк не вплине на величину швидкості зростання мікротрубочки. Однак результати численних експериментів свідчать про те, що в цих умовах поведінка мікротрубочки змінюється драматично — вона перестає рости повністю [32]. Це дійсно інтригуючий результат, так як виходить, що вплив цих інгібіторів в малих концентраціях заснований на більш складному, досі невідомому механізмі. Сьогодні можна з упевненістю стверджувати, що інгібітори тубуліну значно змінюють динаміку мікротрубочки, тільки коли опиняться безпосередньо на ній. У випадку з колхіном це може статися, наприклад, якщо дімір тубуліну спочатку зв’яжеться з ним, а потім приєднається до кінця мікротрубочки. Однак детальний механізм впливу на цьому рівні досі невідомий. У цьому контексті тільки починають з’являтися експериментальні дані, засновані на спробах спостерігати окремі молекули інгібіторів у складі мікротрубочки.

Знайомимося з кожною молекулою особисто

Дослідження фундаментальних механізмів, що лежать в основі такого значного впливу інгібіторів тубуліну на мікротрубочки, можливо завдяки розвитку передових технік світлової мікроскопії і створення високочутливих фотодетекторів. Одна з таких технік дозволяє поглянути на окремі молекули і заснована на флуоресцентній мікроскопії. Це з першого погляду здається нереальним, тому що добре відомо, що дозволяє здатність світлової (в тому числі флуоресцентної) мікроскопії, тобто мінімальний розмір об’єкта, який ми здатні з її допомогою розгледіти, істотно обмежена. Закони оптики дозволяють нам у цьому випадку розрізнити частинку розміром кілька сотень нанометрів, тоді як розміри більшості молекул, у тому числі перерахованих інгібіторів, набагато менші. Подолання цього бар’єру засноване на флуоресцентних властивостях речовин. У загальному розумінні флуоресценція являє собою фізичне явище, при якому речовина випускає власне випромінювання при впливі на неї іншим джерелом світла. Флуоресцентними властивостями володіють деякі речовини, серед яких є відомі білки (наприклад, GFP) та інші органічні або неорганічні молекули і кристали. Одна з основних особливостей флуоресценції цих молекул полягає в тому, що з плином часу з різних причин завжди відбувається так зване фотообесцвічування — явище, при якому власне випромінювання речовини незворотно «згасає», причому за досить тривалий час згасання відбувається повністю. Причиною цього може служити хімічна модифікація флуоресцентних молекул у результаті взаємодії з радикалами кисню, що утворюються під впливом світла [33]. Тут важливо відзначити, що «згасання» відбувається подібно до того, як перегорає лампочка, тобто різко і в найнесподіваніший момент. Така, здавалося б, марна і навіть шкідлива особливість флуоресценції, лежить в основі одного з методів детектування окремих молекул. Він полягає в тому, що спочатку на поверхню скла прикріплюють якомога більш тонким шаром досліджувані молекули. Для цього використовують дуже невеликі концентрації речовини — всього десятки наномоль/літр або навіть менше. Після цього вмикають збуджувальне випромінювання, змушуючи ці молекули світитися, і чекають, поки не відбудеться повне фотообесцвічування часточок, що світяться, на склі в досліджуваній області. Далі йде обробка отриманих експериментальних даних — саме з її допомогою ми дізнаємося, чи вдалося нам спостерігати флуоресценцію окремої молекули, і як вона виглядає (тобто виміряємо її інтенсивність). Обробка полягає в тому, щоб побудувати залежність інтенсивності флуоресценції окремої частинки, що світиться від часу (рис. 6) [34, 35]. У наведених прикладах видно, що «згасання» флуоресценції цих часточок відбувається у вигляді «сходинок», тобто досить швидко і тільки в певні моменти часу. Ці графіки досить просто інтерпретувати, знаючи властивості фотообесцвічування флуоресцентної речовини: кожна така частинка може складатися з однієї або декількох молекул, і її «згасання» в такому випадку відбувається внаслідок «згасання» однієї молекули (якщо сходинка одна) або послідовного «згасання» декількох молекул (у такому випадку спостерігається відповідне число сходинок). Завдяки цим графікам ми знаємо інтенсивність флуоресценції окремої молекули по висоті однієї сходинки і можемо зробити висновок, чи вдалося нам все-таки спостерігати окремі молекули в якості частинок, що світяться на склі.