«Бактерії Delftia acidovorans виділяють речовину, що сприяє біомінералізації золота»

Ріс. 1. Електронна мікрофотографія комплексу дельфтибактину із золотом. Дельфтібактин додали до розчину солей золота за 10 хвилин до того, як була зроблена мікрофотографія. На мікрофотографії видно колоїдні частинки золота (синя стрілочка) і октаедричні частинки золота (червона стрілочка), що утворилися під дією дельфтибактину. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemical Biology

Група канадських вчених виявила новий механізм нейтралізації бактеріями токсичних для них іонів золота. Виявилося, що бактерії Delftia acidovorans, що мешкають на поверхні золотих самородків, виділяють спеціальну речовину, що переводить іони золота з розчину в частинки металевого золота. Ця речовина — пептид дельфтібактин — вибірково пов’язується з іонами золота навіть якщо в середовищі проживання бактерій багато іонів інших металів. На відміну від своїх побратимів по середовищу проживання — бактерій Cupriavidus metallidurans, які нейтралізують іони золота, накопичуючи його всередині клітини, бактерії Delftia acidovorans виділяють дельфтібактин у зовнішнє середовище, в результаті чого золото утворюється поза клітиною.

Мікроорганізми пристосувалися до існування в практично будь-яких умовах, що зустрічаються на нашій планеті. При цьому багато з них не просто «терплять» несприятливе середовище, а «підлаштовують» його під себе. Для цього вони виділяють у зовнішнє середовище спеціальні речовини (так звані вторинні метаболіти), щоб впливати на неї і зробити її більш комфортною. Іноді такі речовини можуть виявитися корисними і для людини. Хороший приклад — антибіотики, які синтезуються багатьма мікроорганізмами, щоб позбавлятися від конкурентів, які претендують на цінні ресурси. Багато з цих природних сполук знайшли застосування в медицині як антибактеріальних агентів.

При дослідженні організмів, що населяють екстремальні для життя місцезнаходження (екстремофілів), вчених насамперед цікавлять механізми пристосування цих організмів до умов зовнішнього середовища. Наприклад, завдяки відкриттю термофільних бактерій Thermus aquaticus, що мешкають в гарячих джерелах при температурах вище 55 ° C, біологи додали в свій арсенал ДНК-полімеразу з цього організму, здатну працювати при високих температурах (до 96 ° C). Тепер цей фермент є в будь-якій біологічній лабораторії, оскільки він незамінний для ПЛР — реакції, що дозволяє синтезувати велику кількість копій певної ДНК.

Екстремофіли, здатні мешкати в навколишньому середовищі з високими концентраціями важких металів і їх солей, називаються металотолерантними організмами. Для бактерій, що населяють поверхню золотих самородків, характерною умовою середовища є висока концентрація іонів золота Au³ +, які токсичні для живих організмів. Тому кожен вид таких бактерій володіє механізмом захисту від присутніх у великих кількостях токсичних іонів золота. Так, для грамотрицької бактерії Cupriavidus metallidurans, одного з двох переважаючих видів мікроорганізмів в біоплівках на золоті, механізм захисту вже був відомий: ці організми поглинають іони A^u3 + і знешкоджують їх, перетворюючи на нетоксичне нерозчинне золото, гранули якого накопичуються в цитоплазмі бактерії (тобто відбувається його біомінералізація).

Говорячи про біомінералізацію, вчені мають на увазі здатність живих організмів до утворення мінералів, причому слово «мінерал» в даному контексті розуміється досить широко (див. огляд: Steve Weiner, Patricia M. Dove. An Overview of Biomineralization Processes and the Problem of the Vital Effect, PDF, 1,58 Мб). Біомінералізація — це в тому числі біогенне утворення самородків, металевих руд тощо. В останні роки з’явилося багато цікавих досліджень у цій галузі, що частково пов’язано з розвитком мікроскопічних методів. Вчені побачили, що багато руд містять в собі залишки клітин бактерій (див.: Wang et al., 2011. Molecular biomineralization: toward an understanding of the biogenic origin of polymetallic nodules, seamount crusts, and hydrothermal vents), що може говорити про біогенне походження цих руд (родовищ нікелю, міді тощо) (Див. також новину Родовища цинку виникли завдяки бактеріям, «Елементи», 19.06.07). А на поверхні багатьох руд і самородків були виявлені зростаючі бактеріальні плівки.

Рис, 2. i — бактерії Delftia acidovorans, ii — бактерії Delftia acidovorans з «вимкненими» генами NRPS (нерибосомних пептид-синтетаз), iii — бактерії Cupriavidus metallidurans. Темний осад нерозчинного золота утворився тільки навколо бактерій Delftia acidovorans з працюючими генами NRPS. Зображення з обговорюваної статті в Nature Chemical Biology

Інший вид, що живе на золоті, — грамотрицька бактерія Delftia acidovorans, — досі був практично не досліджений і механізм його захисту від надлишку іонів золота не був відомий навіть у загальних рисах. Вивченням цього загадкового мікроорганізму і зайнялися канадські вчені з Університету Західної Онтаріо та Університету Макмастера.

В першу чергу необхідно було з’ясувати, де відбувається відновлення іонів золота: зовні або всередині клітин. Для цього досліджувані бактерії виростили на живильному середовищі, а потім залили розчином солей золота Au³ +. Навколо бактерій утворився темний осад нерозчинного золота, що говорило про те, що іони золота ці мікроорганізми відновлюють зовні від себе (рис. 2). Коли той же досвід виконали з Cupriavidus metallidurans, нерозчинного золота навколо бактерій не утворювалося, оскільки ці мікроорганізми відновлюють золото всередині своїх клітин.

Оскільки виявилося, що Delftia acidovorans відновлює золото зовні своїх клітин, дослідники припустили, що для цих цілей бактерія виділяє в зовнішнє середовище якусь спеціальну речовину. Необхідно було виявити гени Delftia acidovorans, відповідальні за синтез цієї речовини. Важливою зачіпкою служило те, що у Cupriavidus metallidurans, яка відновлює золото всередині своїх клітин і тому не виділяє для цієї мети спеціальних речовин назовні, таких генів бути не повинно було.

Як правило, для «налаштування» умов зовнішнього середовища бактерії використовують низькомолекулярні речовини особливої структури — або полікетиди, або нерибосомні пептиди. Полекітеди — це складні органічні речовини, які синтезуються спеціальними ферментами з невеликих молекул органічних кислот. Нерібосомні пептиди, на відміну від звичайних пептидів, синтезуються, як це ясно з назви, не рибосомами, а особливими ферментами, кожен з яких може синтезувати тільки один тип пептида.

Припустивши, що сполука, яка відновлює золото, у Delftia acidovorans відноситься до одного з цих типів хімічних речовин, дослідники почали пошук генів, що кодують ферменти для їх синтезу. За допомогою комп’ютерного аналізу геному Delftia acidovorans вченим вдалося виявити кластер генів, які могли кодувати ферменти для синтезу полікетидів або ферменти для синтезу нерибосомних пептидів. Щоб виявити, чи дійсно ці гени мають відношення до відновлення золота, дослідники «вимикали» їх роботу шляхом вставок невеликих фрагментів ДНК в послідовність гена.

Виявилося, що після «відключення» одного з генів, які кодують нерибосомну пептид-синтетазу, — цей ген назвали delG — бактерії перестають утворювати навколо себе осад нерозчинного золота, навіть якщо іонів золота навколо них дуже багато. Значить, саме цей пептид, який зазвичай утворювався при нормальній роботі гена, кодуючого пептид-синтетазу, і відновлював золото навколо бактерій. Таким чином дослідники відкрили ген, що захищає бактерії Delftia acidovorans від надлишку іонів золота. При нормальній роботі цього гена утворюється нерибосомна пептид-синтетеза — фермент, який синтезує пептид, що виділяється з бактерії і переводить золото навколо неї в нерозчинну нешкідливу форму.

Рис, 3. Структурна формула молекули дельфтібактину. Зображення з обговорюваної статті в Nature Chemical Biology

Порівнявши вміст екстрактів з бактерій з «вимкненим» і «увімкненим» геном delG, дослідники виявили пептид, який відсутній у перших і присутній у значних концентраціях у других. Після виділення і очищення цього пептида його структуру вдалося встановити методами мас-спектрометрії і ЯМР. Пептид отримав назву дельфтібактин (delftibactin, рис. 3).

Щоб підтвердити захисну функцію знайденого пептида, дослідники виростили бактерії з «вимкненими» генами delG, додали розчин солей золота, а також дельфтібактин. При надлишку солей золота в середовищі зростання бактерій придушувалося, але через деякий час після додавання дельфтибактину нормальний ріст бактерій відновлювався, що говорило про те, що токсичний вплив іонів золота усунуто.

Рис, 4. Утворення золотих опадів під дію дельфтибактину. У пробірках в лівому ряду містився розчин AuCl₃ (в концентрації 10 мілімоль/л), дельфтібактину не було. У середньому ряду — розчин солі золота тієї ж концентрації і розчин дельфтібактину (5 мілімоль/л). У правому ряду — солі золота і дельфтібактин присутні в тих же концентраціях, і до того ж додана сіль заліза FeCl₃ в концентрації 5 мілімоль/л. Довжина масштабної лінійки — 20 мм. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemical Biology

Автори вивчили властивості цього цікавого пептида. З’ясувалося, що він здатний працювати в присутності солей інших металів, крім золота (рис. 4). Дельфтібактин успішно працює при високих концентраціях іонів заліза, причому відновлює в таких умовах переважно золото. Специфічність досягається завдяки тому, що дельфтібактин утворює комплекси з іонами металів, і саме під розмір іона золота він «підходить» найкраще.

Рис, 5. Обложення золота чистим дельфтібактином (середній стовпець) і комплексом галлій-дельфтібактин (правий стовпець). Видно, що якщо дельфтібактин вже пов’язаний з галієм, то відновлювати золото він вже практично не здатний. Малюнок з додаткових матеріалів до обговорюваної статті.

За допомогою ЯМР-аналізу була встановлена структура комплексів дельфтібактину з іонами металів (роль іонів металу виконували іони галію; золото не можна було використовувати, оскільки з ним дельфтібактин швидко співосаджується, і утворюється багато нерозчинного матеріалу, що істотно ускладнило б аналіз методом ЯМР). Комплекси дельфтібактину з галієм (рис. 6) осаджували золото на порядок гірше, ніж чистий дельфтібактин (рис. 5), що підтверджувало гіпотезу про те, що галій пов’язується з тими ж групами дельфтібактину, з якими могло б зв’язатися золото, і що структура комплексів дельфтібактину з цими двома металами схожа. При утворенні комплексу з іоном металу молекула дельфтібактину згинається і зв’язується з іоном за допомогою відразу декількох бічних груп. Після того, як іон зв’язався з молекулою дельфтібактину, може відбуватися його відновлення. Залишалося з’ясувати, за яким механізмом воно відбувається.

Рис. 6. Комплекс дельфтібактину з іоном галію. При встановленні структури комплексу галій використовувався замість золота, для того, щоб не відбувалося співосадження золота і дельфтібактину і не утворювалося нерозчинного матеріалу. Однак, встановлено, що комплекс дельфтібактину з іоном золота має таку ж структуру, як комплекс з іоном галію. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Chemical Biology

При дослідженні різних варіантів дельфтібактину з різних штамів Delftia acidovorans дослідники виявили варіант, що відрізняється від основного наявністю додаткової метильної групи в одного з центрів зв’язування металу (цей варіант назвали дельфтібактин В). Від найбільш поширеного дельфтибактину А цей варіант відрізнявся зниженою реакційною здатністю. Ця знахідка виявила, яка з частин молекули дельфтібактину відновлює золото. Автори припустили, що відновлення відбувається за допомогою окислювального декарбоксилювання — це пояснює, чому молекула з більш реакційноздатною формамідною групою краще відновлює золото, ніж молекула з ацетамідною групою (рис. 7).

Рис, 7. Дельфтібактин А (вгорі) і дельфтібактин В (внизу). Дельфтибактин В менш ефективно відновлює золото через наявність позначеної червоним метильної групи, оскільки карбонільна група поруч з нею в такому випадку менш реакційноздатна. Малюнок з додаткового матеріалу до обговорюваної статті.

Автори цього дослідження пройшли великий шлях від повного незнання того, як Delftia acidovorans захищається від надлишку іонів золота в навколишньому середовищі, до відкриття з’єднання, що осаджує золото, і з’ясування механізму роботи цього з’єднання. Дельфтібактин — перший виявлений секретований метаболіт, який захищає бактерій від розчинного золота і сприяє його біомінералізації (рис. 1). Автори відзначають, що знайдене з’єднання облагає золото з розчину його солей набагато швидше і ефективніше, ніж відомі раніше з’єднання з подібними властивостями (наприклад, цитрат), і сподіваються, що їх відкриття знайде практичні застосування.

Джерело: Chad W. Johnston, Morgan A. Wyatt, Xiang Li, Ashraf Ibrahim, Jeremiah Shuster, Gordon Southam & Nathan A. Magarvey. Gold biomineralization by a metallophore from a gold-associated microbe // Nature Chemical Biology. Published online 03 February 2013. Doi:10.1038/nchembio.1179

Юлія Кондратенко