Біолюмінесценція: відродження

Глибоководна риба морської риби

Про авторів

Різноманіття біолюмінесцентних організмів [1]

Морський чорт, що підстерігає на глибині здобич, приваблює «обід» спеціальною «вудки» перед ротом, що світиться кінцем. Медуза, щоб захиститися від крабу, огортає себе рятівним ореолом. Рачок, який отримав нелегку службу в Другу світову війну, дозволяв японським солдатам висвітлювати карти непомітно для противника. Довгий ряд істот, які використовують для своїх (а іноді і чужих) різноманітних цілей дивовижний процес — біолюмінесценцію (від греч. — Але   — «життя» і лат. lumen — «світло»). Здатність випромінювати у видимому діапазоні мають еволюційно різнорідні групи організмів. Серед них деякі бактерії, гриби, корали, медузи, водорості, хробаки, молюски, комахи, риби (але не більш високоорганізовані тварини). Близько 700 пологів містять види, що випускають світло самостійно або завдяки симбіонтам. Біолюмінесценція використовується для залучення видобутку, освітлення, комунікації, маскування, а також як засіб оборони, нападу, відлякування або відволікання, як «любовної» мови, попередження або загрози. Тривалість світіння варіюється від часток секунди до годин, колір — від блакитного до червоного. У бактерій світло створюється в цитоплазмі, у одноклітинних еукаріот — у спеціальних органоїдах, у високорозвинених організмів (комах, риб) — в особливих органах (від скупчень залізистих клітин до складних утворень, що містять люмінесуючі бактерії). Крім внутрішньоклітинного, світіння буває секреторного типу (кальмари для засліплення противника викидають у воду «хмару» з продуктів секреції двох залоз).

Особливість біолюмінесцентних систем у тому, що вони не закріплювалися еволюційно, а формувалися в кожному випадку незалежно. Відомо близько 30 різних механізмів, що забезпечують світіння [2]. На відміну від багатьох структурних білків і ферментів (гістонів, цитохромів, м’язових білків), схожих у філогенетично далеких форм, компоненти біолюмінесцентних систем у споріднених тварин можуть бути різними. Вважається, що біолюмінесценція вперше виникла на стадії переходу від анаеробних форм життя до аеробних, хоча спільної думки з цього питання немає *.

Сутність явища

Природа біолюмінесценції — хімічна. Субстрат люциферин, маленька органічна молекула, окисляється під дією специфічного ферменту люциферази. Люциферини і люциферази у різних біологічних видів хімічно не ідентичні. Всі такі реакції вимагають окислювача (найчастіше молекулярного кисню, іноді перекису водню) і протікають з утворенням проміжних комплексів — органічних перекисних сполук. При їх розпаді вивільняється енергія, яка не розсіюється у вигляді тепла, а збуджує молекули речовини, що випускає фотони (звідси назва «холодне світіння»). Від їх енергії, а значить від типу конкретного люциферину, залежить частота світла (тобто колір). У трьох відомих випадках учасником люциферин-люциферазної реакції стає ще й аденозинтрифосфат (АТФ). Це властиво багатоніжці Luminodesmus sequoia, грибній мушці Arachnocampa flava і всім видам світляків. Біолюмінесценція, однак, може відбуватися і по-іншому. Світіння медузи Aequorea обумовлено взаємодією специфічного білка екватора з іонами кальцію, причому без участі кисню.

Від забобонних страхів до знання

Про загадкове світіння морських вод, риб і деяких грибів писав ще Арістотель (384-322 рр. до н. е.). Мореплавці приписували цьому явищу містичні властивості, вважаючи його джерелом вогонь з преисподней. Однак якщо на початку нашої ери світіння моря намагалися пояснити ефектом бомбардування частинок води сіллю (за аналогією з іскрою з-під кременя, що вдаряє об сталь), а світіння риб — міститься в їх лусці фосфором, то сьогодні ці припущення можуть викликати лише поблажливу посмішку.

Наукові основи біолюмінесценції заклав Роберт Бойль (1627-1691), знаменитий і відомий усім зі шкільної лави (закон Бойля — Маріотта) англійський фізик, один із засновників Лондонського королівського товариства. Він показав абсурдність забобонів і забобонів, породжених цим явищем, виявивши його схожість з горінням — простою хімічною реакцією, яка припиняється за відсутності кисню. Відкачуючи повітря з судини з шматком дерева, що світиться (через гриби), він спостерігав, як випромінювання, поступово слабшаючи, зникає зовсім, але відновлюється, коли в судину знову потрапляє кисень. Вивчення механізмів органічного світіння продовжив Рафаель Дюбуа (1849-1929). З екстрактів люмінесціюючих жуків Pyrophorus він виділив дві фракції, відповідальні за виникнення світла в присутності кисню. Білкову складову, яка втрачала активність при нагріванні (як ферменти), він назвав люциферазою, а термостійку низькомолекулярну — люциферином.

Відтоді було зроблено безліч відкриттів, пов’язаних з природою біолюмінесценції. Однак у 2006 р. нобелівський лауреат Осаму Шимомура, який присвятив понад 50 років свого життя дослідженню цього заворожуючого явища, з жалем зазначив, що значний прогрес, досягнутий у цій галузі, змінився занепадом [2]. На сьогодні відомі структури тільки семи природних люциферинів. Якщо в третій чверті XX ст. були визначені п’ять з них, то в останній чверті — тільки два. До того ж остання структура нового люциферину з динофлагелят (найпростіших організмів, що становлять значну частину морського планктону і світяться від руху водних мас) була охарактеризована вже чверть століття тому [3].

Довгоочікуваний прорив

Нещодавно в таїжних районах півдня Красноярського краю було відкрито новий люмінесціюючий вигляд кольчастих хробаків сімейства енхітреїд. Один з авторів статті (В. Н. Пєтушков), фахівець з люмінесценції бактерій, ще студентом, працюючи вночі на біостанції Красноярського університету, зауважив, що його сліди на землі світяться. Джерелом блакитного випромінювання виявилися дрібні хробаки. Тоді ця знахідка не здалася важливою, і про сибірські черви, що світяться, забули на багато років. А наприкінці 1980-х років В. Н. Пєтушков з колегою Н. С. Родіоновою повернувся на біостанцію, щоб спробувати визначити вид цих істот. З’ясувалося, що світу вони невідомі. За допомогою Н.Т. Залеської, фахівця з безхребетних з московського Інституту проблем еволюційної морфології та екології тварин ім. А. Н. Северцова РАН, було зроблено перший короткий опис нового виду олігохет, названого Fridericia heliota [4].

Світіння хробака Fridericia heliota. Фото А.А. Семенова

Невеликі (довжина дорослої особини 15-20 мм, діаметр 0,5 мм, маса 2 мг) біло-жовті хробаки F. heliota живуть у лісових сибірських грунтах. Вони випускають зеленувато-блакитне світло (максимум спектра випромінювання припадає на 478 нм), який після механічного, хімічного або електричного подразнення поступово протягом приблизно 10 хвилин загасає. Точки, що світяться, розташовані на тілі хробака, а цнотлива рідина (яка заповнює вторинну порожнину тіла) не випромінює. Вважалося, що люмінесценція всіх земляних хробаків має єдиний характер. 12 видів із шести пологів олігохет (Diplocardia, Diplotrema, Fletcherodrilus, Octochaetus, Pontodrilus і Spenceriella) виділяють ціломічну рідину, в клітинах якої міститься біолюмінесцентна система, що включає. Найбільш повно механізм світіння вивчений у великих (довжина близько 60 см, маса 7 г) хробаків Diplocardia longa, що мешкають в піщаних грунтах на півдні штату Джорджії (США). Люциферін D. longa, аліфатичний альдегід N-ізоваліл-Заміно-1-пропаналь, служить субстратом для люцифераз всіх інших олігохет, що світяться. Більш того, люцифераза D. longa активна в крос-реакціях (коли пару взаємодіючих речовин беруть від двох різних видів тварин) з люциферинами інших хробаків [6]. Але сибірський хробак F. heliota виявився унікальним — крос-реакції з люциферинами і люциферазами будь-яких інших організмів дали негативний результат. Це передбачало, що механізм біолюмінесценції у F. heliota та інших видів відрізняється. У 2003 р. спільно з італійським фахівцем з систематики хробаків Е.Рота було опубліковано докладний опис черву з сибірської тайги [7].

Важкий шлях до світла

У 2003-2007 рр. група Пєтушкова провела перші дослідження властивостей біолюмінесцентної системи F. heliota і виявила її необхідні компоненти — нові люциферин і люциферазу, кисень, АТФ та іони магнію. Люциферин і люциферазу очистили, отримали ультрафіолетовий спектр (залежність поглинання від довжини хвилі в ультрафіолетовому діапазоні) люциферину, досліджували рН- і температурну залежність швидкості реакції in vitro, вплив на неї солей і детергентів [8-10]. Ця робота вимагала безперервного надходження біомаси хробаків, яких щорічно з тоннами землі в літньо-осінній період і вдень, і вночі добували в лісах. У 2011 р. Шимомура очолив нову лабораторію біолюмінесцентних біотехнологій в Сибірському федеральному університеті, і роботи з вивчення механізму випускання світла F. heliota продовжилися.

Щоб встановити структуру природної речовини, спочатку її треба виділити в чистому вигляді. З люциферином F. heliota виникли серйозні труднощі через обмеженість біомаси хробаків (ручний збір давав близько 30 г на рік, а в лабораторних умовах ці хробаки не хочуть розмножуватися) і низький вміст люциферину (приблизно 0,1 мкг на 1 г необробленої біомаси) [10]. Ціною величезних зусиль групі Пєтушкова за кілька років з 90 г біомаси хробаків вдалося виділити всього 5 мкг люциферину. Крім нього, екстракт F. heliota містив кілька з’єднань невстановленого складу, які схожі на люциферин за своїми спектральними і хроматографічними властивостями. Вони флуоресціюють так само, як і справжній люциферин, але їм самим не є. Пєтушков припустив, що ці з’єднання — неактивні аналоги люциферину (його попередники або продукти деградації). Значить, вони повинні мати схожу з люциферином структуру. Одним з основних компонентів екстракту хробака (його вміст у 30 разів більший, ніж люциферина) було з’єднання, назване CompX. Виділеної кількості (близько 150 мкг) цілком вистачило, щоб отримати всю інформацію про його структуру [11].

Основний метод визначення складу і будови речовини в сучасній органічній хімії — спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР) ^* *. Його важливий приватний випадок — протонний магнітний резонанс. Ядро атома водню^, 1N, у зовнішньому магнітному полі може перебувати в двох енергетичних станах: його власний магнітний момент (важливо, що він ненульовий) може орієнтуватися за напрямом поля і проти нього. Перехід з нижнього енергетичного рівня на верхній супроводжується поглинанням енергії (  E = h^, де E, h і — енергія, постійна Планка і частота випромінювання відповідно), яке реєструється ЯМР-спектрометром. Ампулу з розчиненою досліджуваною речовиною поміщають у сильне магнітне поле і піддають впливу імпульсів радіочастотного випромінювання. При певних частотах протони резонують — частота імпульсу виявляється рівною частоті переходів між енергетичними рівнями. При виникненні таких переходів зразком поглинається енергія зовнішнього поля. Частота ЯМР залежить від напруженості магнітного поля, а при заданому його значенні — від магнітного моменту досліджуваного типу ядер. Однак частота резонансу для ядер одного хімічного елемента надзвичайно чутлива до їх хімічного оточення. Електронні оболонки атомів і молекул реагують на зовнішнє магнітне поле, частково екрануючи його, що призводить до зміни частоти резонансу — хімічного зрушення. Його величина залежить від оточення досліджуваного ядра, взаємного розташування сусідніх атомів у просторі, зв’язку між ними. Часто зразок містить декілька типів молекул, або складні органічні молекули резонуючі ядра знаходяться в різних атомних групах. Тоді навіть для схожих атомів у близькому оточенні спектр ЯМР покаже різні сигнали, якщо атоми хімічно різні. Положення сигналу в спектрі характеризує будову атомних груп, що оточують досліджуване ядро, а співвідношення амплітуд піків дає інформацію про відносну кількість ядер з різним хімічним оточенням. Більш того, через взаємодію магнітних моментів різних ядер сигнал резонансного поглинання кожного з них може являти собою складний мультиплет (ефект спін-спинової взаємодії), число та інтенсивність компонент якого теж однозначно пов’язані з будовою молекули досліджуваної речовини. Так спектр ЯМР дозволяє розшифрувати хімічну будову і структуру найскладніших органічних сполук.

Структури CompX (а) і його нерідного ізомера (б)

Отже, за даними ЯМР- і мас-спектроскопії (методу дослідження речовини, що вимагає її іонізації і заснованої на визначенні співвідношення маси і заряду утворюваних іонів) М. А. Дубинний і К. Д. Надєждін з Інституту біоорганічної хімії запропонували структуру сполуки CompX. Воно виявилося незвичайним (такої молекули в природі ще не знаходили) похідним амінокислоти тирозину, одержуваним в результаті трьох модифікацій: дезамінування до кетокислоти, метилювання єнола і карбоксилювання ароматичного кільця. Для встановлення конфігурації подвійного зв’язку А. С. Царькова і М. С. Баранов (з ІБХ) синтезували і порівняли спектральні дані обох ізомерів. Z-ізомер (від нього. zusammen — «разом»; коли старші заступники у кожного з атомів вуглецю, що утворюють подвійний зв’язок, розташовані по один бік від неї) виявився ідентичний природному зразку. Тоді як E-ізомер (від нього. entgegen — «проти»; старші заступники в атомів вуглецю з пари — по різні сторони від подвійного зв’язку) мали значимо відмінні спектральні властивості, в тому числі відсутність флуоресценції.

Надзвичайно мала кількість люциферину, здобуту з екстракту хробаків F. heliota, дозволила отримати лише мас-спектри високої роздільної здатності і частину ЯМР-спектрів. За ними були розшифровані три фрагменти структури люциферину: CompX, лізин і лід-аміномасляна кислота (ГАМК). Але як вони з’єднуються між собою, було незрозуміло, оскільки для подальшого дослідження не вистачило люциферину. Найбільш імовірний спосіб, яким вони можуть утворити стійке з’єднання (що не суперечить наявним даним ЯМР), — за допомогою пептидних зв’язків між деякими з їх чотирьох карбоксильних і трьох аміногруп. Дубинний зняв ¹H ЯМР-спектри люциферину при декількох значеннях рН, щоб розрізнити вільні карбоксильні групи і ті, які утворюють пептидні зв’язки з аміногрупами залишків лізину і ГАМК. Справа в тому, що вільні карбоксильні групи переходять з форми COOH в кислому розчині в COO — в нейтральному і лужному середовищі, а ці зміни відображаються на сусідніх групах, за якими спостерігають методом ЯМР. Залежність від pH хімічних зрушень протонів, прилеглих до титованих карбоксильних груп, показала, що в лізині і ГАМК вони вільні, а належні CompX залучені в пептидний зв’язок. Дані мас-спектрів дозволили встановити брутто-формулу люциферину: _C23_H29_N3_O11. Обчислена за нею маса і сумарна маса фрагментів CompX, лізину і ГАМК за вирахуванням двох молекул води, які звільняються при утворенні двох пептидних зв’язків, відрізняються на масу _C2_O3. «Недостача» якраз відповідає залишку щавелевої кислоти (оксалата), невидимої в тих ЯМР-експериментах, які вдалося провести з 5 мкг речовини. Люциферін F. heliota виявився незвичайним олігопептидом, що складається з чотирьох залишків. Спектральним і мас-спектрометричним даним не суперечили тільки чотири структурні ізомери, які відрізнялися порядком пептидних зв’язків, що з’єднують чотири «будівельні цеглинки» люциферину F. heliota — CompX, лізин, ГАМК і оксалат.

Структури чотирьох пептидних ізомерів люциферину F. heliota

Щоб з’ясувати, який з чотирьох пептидних ізомерів відображає будову люциферину, довелося провести їх повний синтез, а потім порівняти ЯМР-спектри синтетичних і природного сполук. З чотирьох синтезованих тільки речовина 1 за всіма спектральними характеристиками виявилася ідентичною природному люциферину. І тільки воно мало здатність випускати світло при додаванні білкового екстракту F. heliota в присутності АТФ і MgSO₄. Більш того, спектри люмінесценції і залежності інтенсивності світіння від концентрації речовини у синтетичної і природного люциферинів були ідентичні [12].

Люмінесценція синтетичного люциферину у присутності екстракту хробаків F. heliota, АТФ, кисню O₂ та іонів магнію Mg^{2 +}

Відкритий люциферин став восьмим відомим науці. 25-річна перерва у встановленні нових механізмів біолюмінесценції в живій природі завершилася. Імовірно в ході відповідної реакції відбувається окислення однієї з трьох вільних карбоксильних груп люциферину, в той час як флуоресцентний залишок CompX відповідає за випускання квантів світла. Аналогічний хімічний процес лежить в основі роботи «паличок, що світяться». У циліндричному пластиковому контейнері, наповненому сумішшю флуорофора і дифенілового ефіру щавелевої кислоти (дифенілоксалата), знаходиться скляна капсула з перекисом водню. При вигині палички внутрішня капсула руйнується, а дифенілоксалат і перекис водню, змішуючись, вступають у хімічну реакцію, продукти якої — дві молекули фенолу і одна ефіру пероксикислоти (1,2-діоксетандіон). Ефір спонтанно розпадається на діоксид вуглецю з виділенням енергії, яка збуджує молекули флуорофору. Останній вивільняє її, випускаючи фотони.

Спектри люмінесценції хробаків F. heliota in vivo, природного і синтетичного люциферинів

Відкриття та розшифровка структури компонента нової біолюмінесцентної системи, крім суто наукового, має і важливе прикладне значення. Явище біолюмінесценції дуже широко застосовується. Мітки, що світяться, використовують для проведення аналізів в медицині і фармацевтиці, в лабораторних дослідженнях — для візуалізації різних фізіологічних процесів і активності генів, вимірювання концентрації АТФ. В екології біолюмінесценцію застосовують для моніторингу навколишнього середовища. У тест-системах для пошуку ліків люциферин-люциферазні реакції служать свого роду лампочкою, що допомагає визначити, чи є в електричному ланцюгу напруга. Люциферін Fridericia heliota неодмінно займе свою нішу в прикладній біолюмінесценції. Він простий у хімічному синтезі, виключно стабільний протягом місяців (а не годин, як найбільш використовуваний сьогодні люциферин — світлячковий) і нетоксичний (на відміну від люциферину бактерій).

Література1

. Roura S., Galvez-Monton C., Bayes-Genis A. Bioluminescence imaging: a shining future for cardiac regeneration // J. Cell. Mol. Med. 2013. V. 17. № 6. P. 693–703.

2. Shimomura O. Bioluminescence: chemical principles and methods. Singapore, 2006.

3. Nakamura H., Kishi Y., Shimomura O. et al. Structure of dinoflagellate luciferin and its enzymic and nonenzymic air-oxidation products // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 7607–7611.

4. Залеська Н.Т., Пєтушков В.М., Родіонова М. С. Почвені енхітреїди (Oligochaeta, Enchytraeidae )//Докл. АН СРСР. 1990. Т. 310. № 2. C. 496–498.5

. Wampler J. E., Jamieson B. G. M. Earthworm bioluminescence: comparative physiology and biochemistry // Comp. Biochem. Physiol. 1980. V. 66B. P. 43–50.6

. Ohtsuka H., Rudie N. G., Wampler J. E. Structural identification and synthesis of luciferin from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa // Biochemistry. 1976. V. 15. № 5. P. 1001–1004.7

. Rota E., Zalesskaja N. T., Rodionova N. S. et al. Redescription of Fridericia heliota (Annelida, Clitellata: Enchytraeidae), a luminous worm from the Siberian taiga, with a review of bioluminescence in the Oligochaeta // J. Zool. 2003. V. 260. № 3. P. 291–299.8

. Petushkov V. N., Rodionova N. S., Bondar V. S. Study of the luminescence system of the soil enchytraeid Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) // Dokl. Biochem. Biophys. 2003. V. 391. P. 204–207.