«Одні й ті самі нейрони в одних ситуаціях змушують рухатися, а в інших — завмирати»

Ріс. 1. Постановочний кадр полювання полярної сови на мишу. Миші такого забарвлення вкрай рідко зустрічаються в природі, зате часті в лабораторіях. Тим не менш, лабораторні гризуни не втратили свої інстинкти: завмерти, якщо над ними в пошуках видобутку курсує хижак, і бігти, якщо він знижується і наближається до них. У першому випадку реакція миші підвищує її шанс залишитися непоміченою, а в другому дає можливість відірватися від переслідування. Як тепер стало відомо, обидва варіанти поведінки контролюються одними і тими ж нервовими клітинами. Фото з сайту pqspb.org

Левова частка успіху виживання — своєчасні і доречні в наявних умовах реакції на подразники. Тому один і той же стимул в різних контекстах нерідко запускає різну поведінку. Нейробіологи з Корнелльського університету показали, як це реалізується на клітинному рівні в разі захисних реакцій у мишей. Якщо рівень небезпеки середній або низький, активність серотонінергічних нейронів дорсальних ядер шва спонукає гризунів завмирати і в принципі менше рухатися. При високому рівні небезпеки сигнали від цих клітин, навпаки, провокують у мишей активне втікання і підвищують рухову активність тварин. Подібним чином поводяться і ГАМК-єргічні нейрони в складі цих ядер.

Якщо дуже сильно спростити, то можна сказати, що життя тварини — це реакції на різні подразники. Сприймають подразники рецептори, а реакцію забезпечують ефектори. Під словом «рецептор» можуть ховатися і цілі органи, і групи клітин, і білкові комплекси в складі таких клітин. А під ефекторами нерідко мають на увазі скелетні м’язи, що забезпечують рухи організму.

Якщо трохи наблизити це спрощення до життя, доречно згадати, що практично жоден стимул не подається ізольовано від інших. Паралельно з ним тварина завжди отримує якісь інші сигнали. Ми чуємо спів птахів і в той же час бачимо їх силуети в небі, рослини, на які вони сідають, відчуваємо запахи квітів і тепло сонця. Правда, ті ж птахи можуть «співати» і у нас в навушниках, коли ми слухаємо записи їх голосу паралельно з роботою на комп’ютері в приміщенні. Головний стимул у цих двох описах один, а контексти зовсім різні.

Якщо ви, наприклад, миша, то трелі співочих птахів навряд чи вам чимось загрожують. Але багато інших стимулів становлять небезпеку, притому в різних умовах ступінь цієї небезпеки неоднакова. Якщо хижак бачить вас, то вам, ймовірно, залишилося жити кілька хвилин. Коли ви його бачите, а він вас ще не помітив, то можна зачаїтися і збільшити шанс, що все обійдеться. Контекст має значення і в ситуаціях, де не треба бігти або оборонятися. Скажімо, ситий звір з меншим полюванням піде за важкодоступною їжею, ніж голодний.

Виходить, що тварині необхідні структури для сприйняття сигналів, структури для відповіді на ці сигнали рухами і структури для оцінки контексту (до них повинна приходити інформація про всі стимули, що діють на організм в даний момент). Останні здатні змінювати характер та інтенсивність рухової відповіді на стимули. У ссавців подібних систем кілька. У їх число входять чорна субстанція середнього мозку з нейронами, що утворюють дофамін, і ядра шва, багато клітин яких виділяють серотонін. Обидві речовини служать нейромодуляторами, тобто регулюють відповіді клітин на стимуляцію з боку інших нейронів.

Ядра шва входять до складу мозкового стовбура — осьової структури, що включає в себе тривалий мозок, а також частини заднього, середнього і, за деякими класифікаціями, проміжного мозку. Це парні утворення, всього їх дев’ять пар, і їх нумерація у людини починається від найближчої до спинного мозку пари ядер. У мишей вони теж присутні, але через різницю в анатомії виходить, що деякі пари з меншим номером виявляються далі від спинного мозку, ніж пари з більшими номерами (рис. 2). Далі ми зосередимося на дорсальних ядрах шва: саме їх стимулювали у піддослідних гризунів в обговорюваній статті.

Ріс. 2. Система серотонінергічних нейронів головного мозку миші (поздовжній розріз по центральній лінії). Червоними лініями відображаються відростки клітин ядер шва — проекції (див. Projection fiber) в інші області мозку. V1-B9 — назви пар ядер шва, MR (зелений еліпс) — медіальні ядра шва, medial raphe, DR (жовтий еліпс) — дорсальні ядра шва, dorsal raphe. Решта структур мозку: Cerebellum — мозочок, Hippocampus — гіпокамп, Frontal cortex — лобна кора, Olfactory bulb — нюшна цибулина, Striatum — смугасте тіло (стріатум), N. accumbens — прилегле ядро, Amygdala — мигдалина (аміґдала), Malfb, Amygdala — Мala — міндалин Зображення зі статті K.-P. Lesch, J. Waider, 2012. Serotonin in the Modulation of Neural Plasticity and Networks: Implications for Neurodevelopmental Disorders

Ядра шва — одне з основних джерел серотоніну в головному мозку. Як можна бачити на рис. 2, вони «роздають» цей нейромодулятор фактично всьому мозку. Підвищений вміст серотоніну в передньому мозку робить лабораторних гризунів менш рухливими і більш схильними до завмирання на місці, а знижене додає тваринам імпульсивності і частішає повторювані рухи (персеверації).

За такою логікою речовини, що обмежують повернення серотоніну з синаптичної щілини у нейрон і тим самим посилюють його вплив на сусідні клітини, повинні знижувати рухливість тварин. Однак на ділі СІОЗС — селективні інгібітори зворотного захоплення серотоніну, велика група речовин, що застосовуються для лікування депресії, — стимулюють рухи піддослідних щурів і мишей. Це виявили під час стандартних поведінкових тестів для оцінки ефектів антидепресантів — тесту примусового занурення (він же тест Порсолта: тварина змушена гребти лапами в тісному наповненому водою циліндрі, щоб не потонути, див. behavioural despair test) і примусового підвішування за хвіст (tail suspension test). Аналогічна дія надає і стимуляція зв’язків дорсальних ядер шва з префронтальною корою — структурою мозку, відповідальною за планування і прийняття рішень.

У спробі вирішити цю суперечність автори обговорюваної статті, опублікованої в недавньому номері журналу Science, звернули увагу на обстановку, в якій гризуни здійснюють рухи. І тест Порсолта, і тест примусового підвішування — вкрай неприємні для тварин процедури. На щастя, далеко не все життя лабораторних мишей проходить в таких некомфортних умовах. Цілком ймовірно, що зниження рухливості піддослідних при високому рівні серотоніну відбувалося в менш стрессуючих ситуаціях, від яких не обов’язково було негайно тікати.

Щоб перевірити гіпотезу про неоднакову дію серотоніну ядер шва на поведінку мишей в різних ситуаціях, дослідники протестували цих гризунів (лінія C57BL/6J, дорослі самці) в чотирьох ситуаціях різного ступеня небезпеки/неприємності для тварин. В одному випадку тварини перебували у відкритому полі (див. Open field) — в даному випадку в скриньці 50 ст.1 50 см з високими бортиками. В іншому вчилися переходити з одного відсіку камери в інший до кінця звучання тону довжиною 8 секунд: тоді в другому відсіку їм давали воду. В експериментах третього типу в аналогічній камері гризунам потрібно було перейти з однієї половини в іншу до закінчення звуку, в іншому випадку на решітчасту підлогу подавали напругу (били мишей по лапах струмом). Найбільш неприємною була ситуація четвертого типу, коли звірів на 6 хвилин приклеювали липкою стрічкою до дощечки за хвіст. Тест Порсолта не використовувався з тієї причини, що в ньому легко намочити місце введення оптоволокон в череп мишей.

Необхідно було з’ясувати, як поводяться серотонінергічні нейрони дорсальних ядер шва в описаних випадках, коли вони активні, а коли ні. Є в ядрах шва і нейрони, що виділяють гамма-аміномасляну кислоту (ГАМК). Вони, очевидно, теж регулюють рухи мишей. Час і ступінь активації серотонінергічних і ГАМК-єргічних нейронів оцінювали за інтенсивністю флуоресценції GCaMP — кальцієвого сенсора, заздалегідь вбудованого в такі клітини за допомогою вірусних векторів. Рівень внутрішньоклітинного кальцію, як правило, зростає при інтенсивній роботі нейрона, тому чим активніше в даний момент клітина, тим вище у неї інтенсивність флуоресценції GCaMP. Як контроль використовували тварин з GFP (зеленим флуоресцентним білком) замість GCaMP.

Ці експерименти показали, що серотонінергічні нейрони дорсальних ядер шва більш активні під час рухів лише в найбільш неприємних умовах — при підвішуванні за хвіст. У більш спокійній обстановці (при переміщенні у відкритому полі, а також в дослідах в камері з двома відсіками) ці ж клітини майже «замовкали» при переміщеннях тварини (рис. 3). ГАМК-єргічні нейрони виявилися чутливішими до загрози: вони інтенсивно працювали під час рухів миші і при підвішуванні за хвіст, і при менш стрессуючому (оскільки миша все-таки могла уникнути неприємностей, втікши в інший відсік камери) уникненні удару струмом.

Ріс. 3. Записи активності серотонінергічних нейронів (флуоресціюють зеленим на зображенні A) дорсальних ядер шва мишей в різних ситуаціях: В—E — тест «відкрите поле» (OFT, open field test), F—I — перехід з одного відсіку камери в інший за дзвінком (tone, відмічений зеленим) за водою (approach task), J—M — перехід з одного відсіку камери в інший за дзвінком (tone, час його звучання позначено зеленими прямокутниками) щоб уникнути удару струмом (avoidance task), N—S — тест примусового підвішування за хвіст (TST, tail suspension test). B, F, J, N — схеми експериментів. C, J, K, O — приклади зміни інтенсивності флуоресценції досліджуваних нейронів (чорні лінії) під час відповідних експериментів у порівнянні зі швидкістю руху тварин (червоні лінії). У разі O червоним відзначені показники акселерометра, що вимірює «напругу» приклеєного хвоста, тобто спроби звільнитися. D, H, L, P, R — співставлені за часом активність досліджуваних нейронів (чорні лінії) і рухова активність мишей (червоні лінії). Видно, що у всіх експериментах, крім примусового підвішування за хвіст, серотонінергічні нейрони дорсальних ядер шва «затихають», коли миша починає рух (movement onset). При підвішуванні за хвіст (P, R) реакція клітин зворотна (R — спроби вирватися не допомогли тварині звільнитися). E, I, M, Q, S — порівняння середньої інтенсивності флуоресценції GCaMP до і після початку рухів тварини в різній обстановці. Знову у всіх випадках, крім двох останніх (Q — невдалі спроби звільнитися), флуоресценція GCaMP, а значить, і активність серотонінергічних нейронів слабшає, коли миша рухається. В останніх двох випадках вона, навпаки, посилюється. GFP — зелений флуоресцентний білок. Однією зірочкою позначено статистично значущі відмінності з P < 0,05, двома — з P < 0,01, ns - відсутність статистично значущих відмінностей. Зображення з обговорюваної статті в Science, зі змінами

Тепер необхідно було зрозуміти, чи є причинний зв’язок між зміною режиму роботи серотонінергічних і ГАМК-єргічних клітин дорсальних ядер шва і руховою активністю мишей в різних ситуаціях. Для цього під час дослідів, аналогічних вже проведеним, вчені стимулювали зазначені клітини методами оптогенетики. У дорсальні ядра шва вводили нанолітри розчину, що містить вірусні вектори. Одні вектори проникали в клітини, на поверхні яких був присутній переносник серотоніну SERT, а інші впроваджувалися в нейрони з переносником ГАМК Vgat на мембрані. Крім GCaMP вектори вбудовували в нейрони обох груп модифікацію жовтого флуоресцентного білка (eYFP, enhanced yellow fluorescent protein). Він, у свою чергу, був пов’язаний з ченнелродопсином ChR2 — іонним каналом. Вплив світлом з довжиною хвилі 473 нм активував ChR2, він починав впускати всередину нейронів шва іони натрію і тим самим активував свої клітини. eYFP при такій стимуляції флуоресціював, чим допомагав виявити ці нейрони. Була і контрольна група тварин, з eYFP, але без ченнелродопсина. У них ГАМК-єргічні нейрони «світилися», але їх неможливо було активувати оптогенетично.

У результаті цих процедур дослідники отримали можливість активувати ГАМК-єргічні (несучі Vgat) і серотонінергічні (несучі SERT) клітини дорсальних ядер шва. Стимулюючи їх світлом в різних експериментальних умовах, вчені встановили, що в найбільш неприємній для мишей ситуації, при підвішуванні за хвіст, активація клітин обох типів змушує тварин рухатися більше і швидше — а при нейтральному контексті, наприклад під час добровільного бігу в колесі (його ставили у відкритому полі), не діє (рис. 4). Але, як і в першій серії дослідів, знайшлися відмінності між реакціями ГАМК- і серотонінергічних клітин. Миша рухалася більше, коли їй стимулювали ГАМК-єргічні нейрони, а вона перебувала у відкритому полі при яскравому освітленні: ці гризуни нічні і відчувають себе незатишно днем без укриття. Аналогічна стимуляція серотонінергічних нейронів ядер шва в тих же умовах призводила до зворотного результату: гризуни частіше завмирали, ніби над ними літав хижак. Це відмінність автори, знову ж таки, списують на різні пороги чутливості до небезпеки у виділяють ГАМК і виділяють серотонін нейронів.

Ріс. 4. Результат стимуляції ГАМК-єргічних нейронів дорсальних ядер шва мишей. A—E — вільний біг у колесі (wheel), F—J — тест примусового підвішування за хвіст (TST, tail suspension test). Optical encoder — пристрій для реєстрації рухів тварини. B, G — приклади зміни інтенсивності флуоресценції досліджуваних нейронів (чорні лінії) під час відповідних експериментів у порівнянні зі швидкістю руху тварин (червоні лінії). У разі G червоним позначено показники акселерометра, що вимірює «напругу» приклеєного хвоста (тобто спроби звільнитися). C, H — зіставлені за часом активність досліджуваних нейронів (чорні лінії) і рухова активність мишей (червоні лінії). При підвішуванні за хвіст активація ГАМК-єргічних клітин дорсальних ядер шва збігається зі спробами миші вивільнитися, а при бігу в колесі такі клітини, навпаки, «замовкають» під час рухів тварини. D, I — порівняння середньої інтенсивності флуоресценції GCaMP до і після початку рухів тварини в різній обстановці. GFP — контроль. Однією зірочкою позначено статистично значущі відмінності з P < 0,05, двома — з P < 0,01, ns - відсутність статистично значущих відмінностей. E, J — частка часу, проведеного твариною в русі, з трихвилинного відрізка експерименту (на кожному графіку по 6 таких відрізків). Відрізки, коли стимуляція ГАМК-єргічних нейронів не виробляється, відзначені білими вертикальними смугами і словом OFF. Відрізки, коли ГАМК-єргічні нейрони стимулюються оптогенетично, відзначені блакитними вертикальними смугами. Сині кола — дані по гризунах з вбудованими в потрібні нейрони ChR2 і eYFP. Чорні квадрати — дані по тваринах, у яких є тільки eYFP (контрольна група). Видно, що рухливість мишей з контрольної групи не залежить від оптогенетичної стимуляції (вона на них і не може подіяти), а рухливість звірів з ченнелродопсином підвищується від такої стимуляції, виробленої в дуже неприємній обстановці. Зображення з обговорюваної статті в Science, зі змінами

Загальний висновок з отриманих результатів: нейрони дорсальних ядер шва регулюють рухову активність мишей, але залежно від ступеня напруженості обстановки роблять це абсолютно по-різному. Якщо небезпеки немає або вона може пройти стороною, активація таких клітин знижує рухливість тварин, а якщо небезпеки не уникнути або її ймовірність принаймні велика, робота ГАМК- і серотонінергічних клітин призводить до підвищення рухової активності своїх власників. За рахунок цієї поведінка тварини виходить більш адаптивною.

Виходить, що в момент сильної небезпеки управління рухами проводиться не так, як у звичайному житті: при цьому задіюються якісь додаткові механізми. В цілому, це не новина. Більше сорока років тому було показано, що самці щурів, яким істотно знизили вміст дофаміну в смугастих тілах (а це один з головних центрів управління рухами) і майже нездатні нормально ходити, починали активно переміщатися, якщо їх кинути у воду, помістити на лід або в оточення кішок (див. J. F. Marshall et al., 1976. Activation-induced restoration of sensorimotor functions in rats with dopamine-depleting brain lesions). Тепер ми можемо припустити, що у тих щурів в критичних ситуаціях теж активувалися клітини дорсальних ядер шва, і це вони забезпечували руху з останніх сил тим, хто вже мало на них здатний. Ймовірно, при цьому працювали й інші системи екстреного запуску рухів.

Джерело: Changwoo Seo, Akash Guru, Michelle Jin, Brendan Ito, Brianna J. Sleezer, Yi-Yun Ho, Elias Wang, Christina Boada, Nicholas A. Krupa, Durgaprasad S. Kullakanda, Cynthia X. Shen, Melissa R. Warden. Intense threat switches dorsal raphe serotonin neurons to a paradoxical operational mode // Science. 2019. V. 363. I. 6426, P. 538–542. DOI: 10.1126/science.aau8722.

Світлана Ястребова