При раку молочної залози основні мутації накопичуються ще в передраковому стані

Ріс. 1. Еволюція окремих клітин при розвитку раку молочної залози. Неінвазивна карцинома протоків молочної залози in situ (DCIS) походить від єдиної клітини та її нащадків. У деяких з цих клітин виникають мутації, надалі вони формують різні популяції (клони, позначені червоним, жовтим і ліловим). DCIS може перетворитися на інвазивну карцину протоків молочної залози (IDC). Автори дослідження встановили, що IDC може походити з різних клонів клітин DCIS. Малюнок з популярного синопсису до обговорюваної статті

Американські вчені вдало скомбінували кілька відомих технологій і отримали новий підхід до дослідження окремих клітин живих тканин. Вони застосували його для аналізу передракового стану молочної залози (карциноми протоків in situ) і його переходу в рак (інвазивну дуктальну карциному). Дослідження 1293 клітин від 10 хворих показало, що основні мутації накопичуються вже в передраковому стані. Розроблений підхід може бути використаний для детального дослідження еволюції клітин інших і типів раку.

Рак молочної залози — найпоширеніше онкологічне захворювання у жінок. Приблизно у 10% жінок рано чи пізно розвивається рак цього типу. У чоловіків він теж зустрічається, але дуже рідко. Найчастіше рак молочної залози — це результат злоякісного переродження клітин протоків молочної залози (дуктальна карцинома) або часток, в яких виробляється молоко (лобулярна карцинома), а всього відомо 18 форм цього раку.

Рак молочної залози більше поширений у розвинених країнах. Це пов’язано, зокрема, з характерним для таких країн невеликим числом дітей в сім’ях, скороченням періоду грудного вигодовування новонароджених (або відмовою від нього), збільшенням тривалості життя (ймовірність захворювання у жінок після 65 років, наприклад, в 5,8 разів вище, ніж до 65 років, і майже в 150 разів вище, ніж до 30 років). За даними ВООЗ у світі щорічно реєструється понад 1,5 мільйонів нових випадків захворювання на рак молочної залози і понад 500 тисяч смертей від нього. При цьому сучасна медицина вже відносно непогано вміє з ним справлятися: у розвинених країнах смертність від цього раку протягом 5 років після постановки діагнозу не перевищує 10-20% (у бідніших країнах, на жаль, смертність істотно вища). Але дослідження тривають.

Найчастіша (на неї припадає близько 80% всіх випадків) і добре вивчена форма раку молочної залози — дуктальна карцинома. Дуже часто, хоча і не завжди, раку передує карцинома протоків молочної залози in situ (ductal carcinoma in situ, DCIS), яка вважається або передраковим станом, або ранньою стадією раку. Вона зазвичай виявляється при мамографії — стандартній процедурі обстеження молочної залози. Передраковим станом DCIS називають тому, що вона являє собою кластер злоякісних клітин, які не схильні до інвазії в сусідні тканини.

З імовірністю 10-30% DCIS перетворюється на справжній рак, інвазивну карциному протоків (invasive ductal carcinoma, IDC), клітини якої вже можуть проростати в навколишні тканини і утворювати метастази. DCIS може перебувати в латентному стані багато років. Точно передбачити її пробудження і перетворення в інвазивну карциному неможливо, тому хворим рекомендується превентивна хірургічна операція з подальшою променевою терапією.

Раніше пропонувалися два сценарії цього перетворення (рис. 2). Згідно з першим сценарієм, DCIS і IDC паралельно розвиваються з нормальних клітин, які незалежно один від одного перетворюються на злоякісні з різними властивостями. Цей сценарій підкріплюється дослідженнями, в яких були виявлені різні молекулярні маркери у DCIS і IDC (див., наприклад, A. Miron et al., 2010. PIK3CA Mutations in In situ and Invasive Breast Carcinomas). Згідно з другим сценарієм, в DCIS формуються різні популяції клонів злоякісних клітин, але лише одна з них проходить через «пляшкове горлечко» — долає базальну мембрану і дає початок IDC (C. F. Cowell et al., 2013. Progression from ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer: Revisited). На користь цього сценарію говорять геномні дослідження, які виявили однакові мутації в клітинах DCIS і IDC. Але досі залишалося неясним, як саме відбувається перетворення карциноми протоків in situ на інвазивну карциному. Вчені з Онкологічного центру ім. М. Д. Андерсона спробували в цьому розібратися.

Ріс. 2. Три сценарії переходу неінвазивної карциноми in situ (DCIS) в інвазивну (IDC) при раку молочної залози. A — незалежне походження DCIS і IDC паралельно з різних малігнізованих вихідних клітин (N1 і N2 — нормальні клітини, що перетворилися на ракові). B — модель еволюційного «пляшкового горлечка»: різні клітини протока молочної залози утворюють еволюціонуючі популяції клонів, але тільки них тільки один з них може подолати базальну мембрану і дати початок інвазивній карциномі. C — мультиклональна інвазія: еволюція геномів нездорових клітин відбувається всередині протоки молочної залози, в результаті утворюється кілька клонів, здатних дати початок інвазивній карциномі. Малюнок з обговорюваної статті в Cell

У DCIS міститься порівняно мало клітин, а IDC гетерогенна (тобто її мутації в її клітинах занадто розонородні), тому відомі методи для порівняння властивостей DCIS і IDC не годилися. Автори обговорюваної роботи модифікували, вдосконалили і звели воєдино ряд вже відомих методів. У результаті вийшов новий підхід, названий топографічним секвенуванням окремих клітин (Topographic Single Cell Sequencing, TSCS). З його допомогою вдалося простежити, які зміни відбуваються в геномах окремих клітин при виникненні DCIS з нормальних і при перетворенні DCIS в IDC.

Вчені брали зразки тканини у пацієнтів з DCIS і IDC і на гістологічних зрізах визначали локалізацію клітин цих захворювань за морфологічними відмінностями від нормальних клітин. Також визначалися області з нормальною тканиною. Далі з цих ділянок лазером вирізали окремі клітини і за допомогою лазера ж переміщували їх в окремі пробірки (рис. 3). Це дозволило звести до мінімуму ймовірність забруднення стороннім матеріалом. Після цього вчені приступили до геномних досліджень. Клітини лизували і ампліфікували їх ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з «виродженими» праймерами (degenerate oligonucleotide primed PCR).

Ріс. 3. Схема топографічного секвенування окремих клітин. A — зріз тканини, пофарбований гематоксилін-еозином. B, C — вирізання окремих клітин лазером і перенесення їх у пробірки. D — підготовка клітин до повногеномного дослідження (WHA). Малюнок з обговорюваної статті в Cell

Отриманий матеріал аналізували методами високоефективного секвенування нового покоління. Так були охарактеризовані 1293 пухлинні клітини, отримані від 10 хворих на рак молочної залози. Високоефективне секвенування дозволяє не тільки визначити послідовність нуклеотидів ДНК, але й оцінити кількість копій різних ділянок ДНК в геномі. У результаті виявилося, що і в клітинах DCIS, і в клітинах IDC клітинах є істотна варіація числа копій генів (рис. 4).

Ріс. 4. Вгорі — приклад розподілу по геному аномального числа копій різних ділянок ДНК клітин IDC (invasive) і DCIS (in situ) порівняно з нормальними клітинами. Внизу — аномальний розподіл копій ділянок геному в трьох клонах ракових клітин однієї з хворих і локалізація деяких генів, пов’язаних з ініціацією і прогресією раку. Цифри у верхньому ряду позначають номери хромосом. Малюнки з обговорюваної статті в Cell

Втрата або ампліфікація різних ділянок геному, загалом, властиві раковим клітинам. Автори скористалися цим і, порівнюючи профілі варіації числа копій генів, простежили перехід від нормальних клітин до DCIS і до IDC. Цьому сприяло те, що багато з ділянок геному, у яких спостерігалася зміна кількості копій, пов’язані з формуванням і прогресією пухлин.

У чотирьох хворих IDC виявилися нащадками одного клону клітин DCIS, а в інших шести — нащадками декількох (від двох до п’яти) різних клонів клітин DCIS. Але у всіх випадках клітини і DCIS, і IDC походили від єдиної батьківської нормальної клітини (рис. 1), а подальші аномалії геному в різних клонах накопичувалися внаслідок генетичної дивергенції. Отримані результати представляються достовірними, оскільки було досліджено більше тисячі індивідуальних клітин від 10 хворих.

Потім, щоб порівняти набори точкових «ракових» мутацій, автори провели детальне секвенування ділянок геномів, що кодують білки. І в DCIS-, і в IDC-клітинах було знайдено в середньому по 23 мутації, які можуть мати відношення до ініціації і прогресії ракових пухлин. Зокрема, мутації виявлялися в генах TP53, PIK3CA, NCOA2, ABL2, PDE4DIP, AHNAK, RUNX1. Але в IDC-клітинах не спостерігалося статистично достовірного накопичення нових мутацій порівняно з DCIS. Отже, практично вся «злоякісність» виникла вже при формуванні DCIS.

Таким чином, автори розробили новий комплексний підхід для секвенування ДНК з окремих клітин і застосували його для аналізу еволюції геному ракових клітин на ранніх стадіях розвитку раку молочної залози. Виявилося, що основні події еволюції — перебудови геному клітини і накопичення властивих раку мутацій — відбуваються вже при формуванні передракового стану (DCIS), тобто до того, як клітини набудуть здатність до інвазивного зростання (і розвинеться власне рак, інвазивна карцинома протоків — IDC). Всі клони і передракових, і ракових клітин відбуваються, очевидно, з єдиної нормальної батьківської клітини. Набути здатності до інвазивного зростання можуть як один, так і кілька клонів клітин DCIS. Ця модель, названа «мультиклональна інвазія» істотно відрізняється від раніше запропонованих моделей незалежної еволюції та еволюційного «пляшкового горлечка».

Проте залишаються невирішеними важливі проблеми. Поки немає відповіді на головне питання: що ініціює перехід начебто нешкідливого передракового стану (DCIS) в агресивну карциному IDC? Оскільки цей перехід відбувається не завжди, то, можливо, є дві форми DCIS: з низьким і високим ризиком трансфомації в IDC. Потрібно буде визначити тонкі відмінності між ними. Можливо, їх вдасться знайти на рівні експресії певних генів або на рівні епігенетичних відмінностей в хроматині, наприклад, метилювання ДНК або гістонів, що впливають на експресію певних генів. А підхід, запропонований американськими онкологами в обговорюваній роботі, повинен допомогти не тільки в подальших дослідженнях з цієї теми, але може бути з успіхом застосований для дослідження клітин та їх еволюції при інших онкологічних захворюваннях — невипадково ця ювелірно виконана робота опублікована в найавторитетнішому журналі з молекулярної біології.

Джерела:

1) A. K. Casasent et al. Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2017.12.007.

2) D. S. Micalizzi, S. Maheswaran. On the trail of invasive cells in breast cancer // Nature. 2018. (Популярний синопсис до обговорюваної статті).

В’ячеслав Калінін