«Виявлено білок, що відповідає за злиття м’язових клітин у м’язові волокна»

Ріс. 1. Ілюстрація диференціації міобластів і злиття їх в єдиний багатоядерний синцитій. Зі статті: C. F. Bentzinger, Y. X. Wang, M. A. Rudnicki. Building muscle: molecular regulation of myogenesis // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2012. V. 4. P. a008342

При формуванні м‘язів під час ембріонального розвитку однією з ключових подій є злиття міобластів (клітин — попередників м‘язових клітин) в єдине багатоядерне м‘язове волокно — синцитій. І хоча генетичні механізми, які керують розвитком скелетних м‘язів, добре вивчені, механізм, що координує злиття міобластів, залишався не до кінця зрозумілими. Було відомо безліч білків, що тим чи іншим чином мають відношення до злиття міобластів (залучених в адгезію клітин, динаміку актину тощо), проте жоден специфічний для м‘язових клітин білок не відповідав саме за злиття клітин в один загальний синцитій. Вчені з техаського Південно—західного медичного університету виявили специфічний мембранний білок м‘язових клітин (його назвали міомейкер), який експресується під час формування м‘язів і необхідний для злиття міобластів.

Закладка м’язової тканини і формування м’язів — міогенез (див. myogenesis) — відбувається під час внутрішньоутробного розвитку, причому в кілька стадій, кожна з яких принципово важлива для розвитку організму, управляється кількома різними білками і порушення кожної з яких може призвести до недорозвинення будь-яких груп м’язів.

Основними стадіями міогенезу є: деламінація (поділ шарів клітин), міграція клітин, проліферація (розростання тканини шляхом ділення клітин) і два етапи спеціалізації клітин — детермінація (вибір клітиною програми розвитку) і диференціювання (явно виражена спеціалізація). Ці стадії відбуваються на внутрішньоклітинному рівні, це перший етап міогенезу. На другому етапі відбувається вже формування самої м’язової тканини, для чого необхідні стадія злиття клітин у витягнуті багатоядерні м’язові клітини — міоцити і утворення м’язових волокон, а також стадія утворення клітин-сателітів (тобто клітин, необхідних для регенерації, відновлення і зростання м’язистури вже в дорослому стані).

М’язові волокна, з яких складаються м’язи, являють собою синцитій — результат злиття декількох клітин-попередників (міобластів). Причому процес злиття цих клітин повинен бути високоспецифічним: щоб один міобласт зливався з іншим таким же міобластом, але не з кліткою іншого типу. І хоча білки, які керують розвитком скелетних м’язів, добре вивчені, до останнього часу було незрозуміло, що координує злиття міобластів. Було відомо, що є білки, необхідні тільки на першому етапі міогенезу (наприклад, білки Pax3, c-met), і є білки, необхідні і на другому етапі (білки MyoD, Myf5, Myogenin). Однак було неясно, який білок відповідає саме за злиття мембран м’язових клітин в один загальний синцитій і утворення м’язових волокон.

Щоб виявити якісь гени, задіяні на цьому останньому етапі, група вчених з техаського Південно-західного медичного університету порівняла експресію генів, що відповідають за основні білки пізніх стадій міогенезу (наприклад, білок MyoD), і експресію інших генів з геному миші, про які не було відомо, чи беруть вони участь у формуванні м’язів. Серед генів, експресія яких підвищувалася одночасно з експресією міогенних білків, був ген, який кодує трансмембранний білок з невідомою функцією. Автори припустили, що цей білок необхідний для пізніх стадій міогенезу, і назвали його «міомейкер».

Подальші дослідження підтвердили припущення авторів статті: виявилося, що експресія гена, який кодує білок міомейкер, різко зростає під час диференціювання і злиття клітин м’язової клітинної лінії C2C12. Щоб з’ясувати, як відбувається формування м’язів біля зародків мишей, у яких ген, що відповідає за білок міомейкер, вимкнений («мовчить»), автори використовували наступну схему. Кожен ген є в клітці, як правило, в двох варіантах-аллелях, один з яких дістається від матері, а інший — від батька. Автори по черзі вимикали один або обидва алелі гена, що відповідає за білок міомейкер. Таким чином вони створили два варіанти мутантних зародків мишей з вимкненим геном білка-міомейкера: гетерозіготні (з одним «мовчачим» алелем) і гомозіготні (з двома «мовчачими» алелями міомейкера, тобто з повністю вимкненим геном і з повною відсутністю відповідного білка).

Для вимикання гена автори користувалися наступним методом: вставляли всередину гена, який потрібно вимкнути, інший ген, продукт якого легко виявити при фарбуванні певним методом. Якщо при фарбуванні автори бачили продукт вбудованого гена, можна було зрозуміти, що другий ген вбудувався вдало, тобто що цільовий ген вимкнений.

Виявилося, що у зародків мишей, гомозіготних за відсутністю гена міомейкера, немає диференційованих м’язів голови, тулуба або кінцівок (відмінності стали помітні вже на 12,5 день внутрішньоутробного розвитку; див. рис. 2), і це незважаючи на те, що інші білки, що відповідають за розвиток м’язів, наприклад білок MyoD, були присутні в звичайній кількості. Більш того, ранні етапи формування м’язів у зародків були в нормі, зародки мали абсолютно нормальні внутрішні органи і продовжували нормально дихати і розвиватися до певного моменту.

Ріс. 2. Порівняння нормального (+/+) і гомозіготного за відсутністю гена міомейкера (-/-) зародків на 12,5 день. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Треба зауважити, що відмінності в розвитку скелетної мускулатури зародку порівняно з контролем видно вже на 17,5 день внутрішньоутробного розвитку (рис. 3). Вчені також порівнювали зрізи різних м’язових тканин, на яких явно видно утворення м’язових волокон у нормальних зародків мишей, в той час як у зародків мишей, у яких не було білка міомейкер, в тих же самих тканинах і на тих же етапах м’язові клітини як і раніше знаходилися в одиночному, розпушеному стані. Жоден мишеня, який не мав робочого гена, що відповідає за білок міомейкер, не прожив після народження і декількох днів через повну нерозвиненість скелетної мускулатури.

Ріс. 3. Порівняння двох зародків миші на 17,5 день: вгорі — нормальний, внизу — без білка міомейкера. Праворуч — порівняння зрізів мови зародку на 17,5 день; явно видно появу волокон на зрізі нормального зародка (вгорі). Довжина масштабної лінійки: ліворуч — 2 мм, праворуч — 100 мкм. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Щоб підтвердити свої дані, автори виділили міобласти із зародка і спостерігали за ними окремо від усього організму — при цьому клітини зародка дикого типу (контроль з нормальним геном білка міомейкера) через 3 дні диференціювання почали формувати багатоядерні м’язові волокна. Клітини ж зародка, гомозіготного за відсутністю гена міомейкера, так і залишалися одиночними міобластами: злиття клітин з утворенням м’язових волокон не відбувалося.

У наступному досвіді вчені вирішили вбудувати додаткові копії гена білка міомейкера в м’язову клітинну лінію за допомогою спеціального ретровірусного вектора, таким чином «розмноживши» в геномі копії гена білка міомейкера (для контролю в іншу лінію вбудували «порожній» ретровірусний вектор, який не містить нічого, крім флюоресцентного білка GFP). На 4-й день після початку досвіду серед отриманих клітин було помітно більше багатоядерних клітин, ніж у контролі (рис. 4). При цьому кінетика експресії інших факторів, необхідних на етапі злиття клітин (міогенін, MyoD і т. д.), у клітинах зі збільшеним вмістом міомейкера була така ж, як у контрольних клітинах. Збільшення копій гена, що кодує білок міомейкер, призводило не тільки до злиття м’язових клітин у волокна, але і до злиття самих м’язових волокон. Тобто при надлишковій кількості білка злиття клітин відбувалося занадто активно, так що навіть викликало злиття на більш високих рівнях.

Ріс. 4. Порівняння клітинної лінії S1S12 з додатковими копіями гена міомейкера (праворуч, Myomaker) і без них (ліворуч, GFP). Зображення з обговорюваної статті в Nature

Цікаво, що в дослідах на інших, немишкових, типах клітин (наприклад, фібробластах), клітини з «доданою» активною копією гена, кодуючого білок міомейкер, здатні зливатися з м’язовими клітинами, що призводить до утворення гібридних, «неправильних» клітин.

Автори з’ясували, що міомейкер — це висококонсервативний білок, що складається з 221 амінокислоти і наявний у всіх хребетних, починаючи від риб і закінчуючи людиною. За допомогою експериментів з антитілами, а також вестерн-блоттингу було встановлено, що білок знаходиться в мембрані; це також підтверджується тим, що у нього є гідрофобні регіони, що характерно для всіх мембранних білків.

Таким чином, техаські вчені відкрили необхідний для міогенезу білок, без якого неможливо утворення м’язових волокон. Цей білок знаходиться в мембранах м’язових клітин і викликає їх «об’єднання» в одне м’язове волокно. Можливо, це відкриття в майбутньому допоможе при лікуванні різних захворювань м’язів. Наприклад, додаткове введення цього білка або гена, який його кодує, можна буде використовувати при лікуванні дистрофій, пов’язаних з порушенням формування м’язів.

Джерело: Douglas P. Millay, Jason R. O’Rourke, Lillian B. Sutherland, Svetlana Bezprozvannaya, John M. Shelton, Rhonda Bassel-Duby, Eric N. Olson. Myomaker is a membrane activator of myoblast fusion and muscle formation // Nature. 2013. V. 499. P. 301–305.

Див. також:

C. Florian Bentzinger, Yu Xin Wang, Michael A. Rudnicki. Building muscle: molecular regulation of myogenesis // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2012. V. 4. P. a008342. Огляд у відкритому доступі.

Ілля Скляр