Виявлено фундаментальну схожість між розвитком актинії і розвитком хребетних

Ріс. 1. Організатор Шпемана — Мангольд. Вгорі: схема знаменитого експерименту Ганса Шпемана і Хільди Мангольд. Ділянка дорсальної (dorsal), тобто спинної, губи бластопора гаструли тритону (donor embryo), пересадили в іншу гаструлу — реципієнта. В результаті у реципієнта сформувалася додаткова вісь тіла: спочатку з’явилася зайва нервова платівка, а потім і цілий зайвий тритончик. Вийшли «сіамські близнюки». Додатковий тритон сформувався не тільки і не стільки з пересаджених клітин ембріона-донора, скільки з клітин реципієнта, доля яких в нормі повинна була бути зовсім іншою. Внизу зліва — результат такого ж експерименту на шпорцевій жабі. Внизу праворуч — спрощена схема роботи шпеманівського організатора. Сигнальний каскад за участю білка Wnt, що секретується клітинами, і внутрішньоклітинного регулятора транскрипції білка, — catenin змушує клітини організатора виробляти «дорзалізуючі фактори» (білки Noggin, Chordin та ін.), які нейтралізують дію «вентралізуючих факторів» (BMP4). У результаті ектодермальні клітини поруч з організатором починають перетворюватися на нервову платівку, а ті, що розташовані далеко від нього, під дією вентралізуючих факторів стають клітинами шкіри та інших тканин. Зображення з робіт E. M. De Robertis і його колег

В онтогенезі хребетних ключову роль грає «організатор Шпемана — Мангольд» — група клітин, розташована біля спинного краю бластопора на стадії гаструли. Організатор виробляє сигнальні білки, що організовують поведінку інших ембріональних клітин таким чином, щоб з них у підсумку вийшов нормальний організм. Пересадка фрагмента організатора в довільне місце іншого ембріона призводить до формування додаткової осі тіла (виходять «сіамські близнюки»). Експерименти на ембріонах актинії Nematostella показали, що у цього представника нижчих багатоклітинних край бластопора теж є осьовим організатором, причому в основі його роботи лежить активність того ж сигнального каскаду, що і у хребетних (Wnt/­-catenin). Поряд з наявними (досить уривчастими) даними по роботі організаторів у інших безхребетних виявлені факти свідчать про те, що бластопоральний осьовий організатор — стародавня структура, що існувала вже у загального предка книдарій і білатерій.

Відкриття Ганса Шпемана (Hans Spemann) і Хільди Мангольд (Hilde Mangold), які показали, що невелика ділянка гаструли (дорзальна губа бластопора) фактично змушує навколишні клітини організуватися в складний цілісний організм (рис. 1), стало поворотною точкою в розвитку ембріології. Цей експеримент відкрив завісу таємниці над фундаментальними принципами онтогенезу багатоклітинних (див.:Як клітини розуміють, що одні повинні стати волоссям, інші кістками, треті мізками тощо?) і намітив напрямки подальших досліджень, які в підсумку породили сучасну еволюційну біологію розвитку (evolutionary developmental biology, evo-devo).

Ключову роль у формуванні та роботі шпеманівського організатора відіграє сигнальний каскад Wnt/^-catenin (див. Wnt signaling pathway). Щоб створити повноцінний ектопічний (тобто знаходиться в недозволеному місці) організатор, здатний забезпечити формування додаткової осі тіла, досить активувати в якому-небудь бластомері кілька генів — компонентів каскаду Wnt/^-catenin (у разі шпорцевої жаби Xenopus це гени Wnt-1, Xwnt-8, dishevelled, ^-catenin) — і відключити один ген, переважний роботу.

Бластопоральний осьовий організатор був відкритий і найбільш детально вивчений біля амфібій. При цьому його еволюційне походження довгий час залишалося неясним. Чи є його наявність унікальною рисою хребетних? Або гомологічні ембріональні структури є і у інших тварин, і тоді момент появи бластопорального організатора слід відсунути далі в минуле — може бути, до загальних предків всіх вторинноротих, білатерій, Eumetazoa або взагалі всіх тварин?

Існування осьових організаторів — груп клітин, пересадка яких індукує розвиток додаткових осей тіла, — раніше було продемонстровано у цілої низки безхребетних: морських їжаків, мечехвостів, павуків, кільчастих хробаків, гідроїдних поліпів та інших. Але немає твердої впевненості, що ці осьові організатори гомологічні організатору Шпемана — Мангольд. В принципі організатори могли виникати незалежно в різних еволюційних лініях, а робота їх гіпотетично може бути заснована на різних сигнальних каскадах, які в ході еволюції залучалися («кооптировались») для виконання схожих функцій.

Наприклад, показано, що приротовий конус (гіпостом) дорослої прісноводної гідри, якщо пересадити його в стінку тіла іншого поліпа, індукує формування додаткової осі тіла — поліпа-близнюка. Таким чином, гіпостом гідри є осьовим організатором. Однак він відрізняється від шпеманівського організатора як мінімум тим, що працює на стадії дорослого організму, а не гаструли, і прилягає не до бластопора, а до рота дорослої особини. Гаструляція у гідри відбувається таким чином, що бластопор як такий взагалі не формується (способи гаструляції книгарій вкрай різноманітні, див.:Юлія Краус. Гаструляція книдарій: ключ до розуміння філогенезу чи хаос вторинних модифікацій?). Крім того, молекулярні основи роботи осьового організатора гідри відомі лише в загальних рисах (показано, що його робота пов’язана з каскадом Wnt/^-catenin, але подробиці невідомі).

Більш зручним об’єктом для з’ясування питання про те, чи є у нижчих багатоклітинних бластопоральний осьовий організатор, гомологічний організатору Шпемана — Мангольд, є актинія Nematostella (див.:Геном актинії виявився майже таким же складним, як у людини, «Елементи», 11.07.2007). У неї, на відміну від гідри, гаструляція інвагінаційна (відбувається шляхом заплямування), і тому є добре виражений бластопор.

Юлія Краус з кафедри біологічної еволюції біофаку МДУ та її колеги з Віденського університету раніше показали, що в актинії пересадка фрагмента губи бластопора (але не інших частин ембріона) викликає формування ектопічної осі тіла, тобто актинії-близнюка. Таким чином, у нематостелли, як і у хребетних, є бластопоральний осьовий організатор (Y. Kraus et al., 2007. The blastoporal organiser of a sea anemone).

У новій статті, опублікованій в журналі Nature Communications, Краус і її колеги повідомляють про результати подальших досліджень цього організатора, які показали, що не тільки загальні властивості і розташування, але і молекулярні основи його роботи схожі з такими у хребетних.

Попередні досліди показали, що штучна активація сигнального каскаду Wnt/­-catenin може призводити до формування додаткових осей тіла (для цього автори за допомогою системи CRISPR/Cas9 виводили з ладу ген APC, що переважає роботу каскаду Wnt/­-catenin). Значить, даний каскад з великою ймовірністю дійсно якось пов’язаний з роботою організатора. Тепер потрібно було розібратися в деталях.

У геномі актинії є цілих 13 генів, які кодують різні версії позаклітинного сигнального білка Wnt. На стадії гаструли вони експресуються в різних частинах ембріона. Оскільки властивостями осьового організатора володіє тільки губа бластопора, автори зосередилися на п’яти з них: Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt4 и WntA. Зони експресії цих генів на стадії середньої гаструли мають вигляд концентричних, частково перекриваються кілець навколо бластопора. Щоб ще сильніше звузити коло пошуку, автори провели серію експериментів з трансплантації (рис. 2). Це дозволило встановити, що найбільш вираженою організуючою здатністю володіють клітини, розташовані на вигині губи бластопора (сектор 2 на рис. 2). У цій зоні експресуються Wnt1, Wnt3, WntA і, можливо, Wnt4, але не Wnt2. Таким чином, залишилося чотири «підозрюваних».

Ріс. 2. Експерименти з точної локалізації ділянки губи бластопора, що індукує формування додаткової осі тіла. Ліворуч — схема експерименту, праворуч — результати. Фрагмент одного з чотирьох секторів губи бластопора пересідав на аборальну сторону іншої гаструли (зліва вгорі). Це призводило до одного з трьох результатів: або розвивався нормальний поліп без додаткових осей (цей варіант на малюнку позначений світло-зеленим кольором), або формувався недорозвинений додатковий поліп (рудий колір), або розвивалася повноцінна друга вісь тіла (червоно-коричневий колір). Діаграма справа показує, що другий з чотирьох секторів губи бластопора індукує розвиток зайвої осі тіла найбільш ефективно. Червоними стрілками на фотографіях показані горлянки поліпів. На малюнках, що зображують поперечний зріз гаструли, сірим кольором позначена ектодерма, блакитним — ендодерма. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Автори виготовили плазміди, що містять кожен з чотирьох генів-кандидатів, і стали інъецировать їх в клітини ембріонів. З’ясувалося, що експресія WntA і Wnt4 не веде до формування зайвих осей тіла, тоді як експресія Wnt1 і Wnt3 іноді стимулює розвиток частково сформованих додаткових поліпів.

Найпотужнішою організаційною дією володіє спільна експресія Wnt1 і Wnt3. Якщо ці гени працюють разом в одній і тій же ділянці ембріона, то додаткова вісь тіла формується в 50% випадків, а багато хто з утворених зайвих поліпів виявляються повністю розвиненими. Пересадка клітин зі штучно викликаною ектопічною експресією цих генів працює так само, як і пересадка фрагментів сектора 2 губи бластопора, тобто такі клітини набувають властивостей осьового організатора.

Ці результати показують, що формування «голови» (орального кінця тіла) у нематостелли дійсно індукується сигнальним каскадом Wnt/^-catenin, причому Wnt1 і Wnt3 спільними зусиллями надають організуючі властивості ембріональним клітинам.

Додаткові експерименти підтвердили цей висновок. Зокрема, автори обробляли ранні ембріони актинії речовиною AZK (1-Azakenpaullone), яка невибірково активує каскад Wnt/^-catenin у всіх клітинах (рис. 3, вгорі). Це призвело до радикальної «оралізації» ембріонів. Іншими словами, у них не формувався нормальний аборальний кінець тіла (який у дорослого поліпа стає «ніжкою»), а замість цього вся аборальна сторона покривалася складками і дрібними отворами, ніби ембріон намагався наробити собі ротів всюди (рис. 3).

Ріс. 3. Штучне посилення передачі сигналу по каскаду Wnt/^-catenin призводить до «оралізації» ембріонів. Зліва — спрощена схема каскаду Wnt/^-catenin. Позаклітинний сигнальний білок Wnt взаємодіє з рецептором Fz. Це призводить до інактивації комплексу білків, що включає білок GSK3β. Цей комплекс, будучи в робочому стані, інактивує білок лід-catenin. Звільнившись від гнізда GSK3β і його спільників, бета-катенін відправляється в ядро, де, через ряд проміжних етапів, запускає експресію підконтрольних генів (Target genes). Речовина AZK блокує роботу GSK3β, що веде до посиленого надходження бета-катеніна в ядро навіть без зовнішньої «команди», що подається білком Wnt. j, k — ембріон актинії після обробки речовиною AZK, через 72 години після запліднення. j — його оральна сторона (видно бластопор), k — аборальна сторона, спіщрена складками і дрібними отворами. l — нормальна личинка актинії (планула) через 72 години після запліднення, вид збоку. У неї є рот (колишній бластопор) на оральному кінці (відзначений зірочкою) і нормальна, гладка аборальна сторона з пучком реснічок (апікальним органом) на вершині. Зображення з обговорюваної статті в Nature Communications

Крім того, обробка речовиною AZK призводить до того, що кільця експресії деяких генів Wnt (а саме Wnt1, Wnt2 і Wnt4) відсуваються від бластопора і зміщуються в аборальному напрямку. Мабуть, це означає, що в регуляції сигнальних каскадів c участю Wnt задіяні негативні зворотні зв’язки: занадто інтенсивна передача сигналу (коли багато бета-катеніну надходить в ядро) гальмує виробництво деяких білків Wnt. Так чи інакше, у ембріонів, оброблених AZK, область спільної експресії генів Wnt1 і Wnt3 виявляється вже не біля бластопора, а на аборальній стороні. Відповідно до цього, клітини губи бластопора, взяті у таких ембріонів, при пересадці вже не здатні індукувати додаткові осі тіла у ембріонів-реципієнтів. Зате цю здатність набувають аборальні клітини ембріонів, оброблених AZK, — ті самі клітини, в яких спостерігається спільна експресія Wnt1 і Wnt3.

Додаткові експерименти також показали, що на більш ранніх етапах розвитку Wnt1, Wnt3 і WntA експресуються в клітинах пре-ендодермальної платівки (яка потім, в ході гаструляції, впячується всередину і дає початок ендодермі). Можливо, ці гени спочатку беруть участь у диференціюванні майбутньої ендодерми, а потім, відслуживши цю службу, приступають до наступної. Область їхньої експресії розповзається в сторони від ендодерми і набуває вигляду кільця навколо бластопора. Це кільце і стає осьовим організатором.

Автори також вивчили роботу багатьох інших генів на різних етапах ембріонального розвитку актинії. Це дозволило виявити додаткові риси схожості між бластопоральними осьовими організаторами актинії і хребетних.

У хребетних шпеманівський організатор бере участь у формуванні як передньо-задньої полярності (ключову роль у цьому відіграє Wnt-каскад), так і спинно-черевної (дорзо-вентральної). У шпеманівському організаторі бета-катеніновий сигнал запускає синтез «дорзалізуючих факторів» (антагоністів BMP), таких як chordin (рис. 1); той бік тіла, де вплив BMP на клітини ектодерми пригнічується цими білками, стає спинним. У радіально-симетричних книдарій, таких як гідра, вісь тіла тільки одна — орально-аборальна. Вона відповідає, судячи з усього, передньо-задній осі білатерій. Але у класу Anthozoa (коралові поліпи), до якого належить актинія, є також і друга вісь тіла — «директивна вісь». Можливо, вона гомологічна дорзо-вентральної осі білатерій, оскільки ключову роль у її формуванні відіграють гени Dpp і Chd, гомологічні генам bmp4 і chordin хребетних. Спочатку Dpp і Chd експресуються рівномірно навколо бластопора, а потім, на стадії пізньої гаструли, зона їх експресії стає асиметричною. Ця асиметрія і задає директивну вісь. Результати, отримані авторами, свідчать про те, що формування директивної осі, засноване на роботі BMP-каскаду, на ранніх етапах контролюється сигнальною системою Wnt/^-catenin, але потім стає незалежним від Wnt. Це дуже схоже на те, що спостерігається у хребетних.

Таким чином, у актинії Nematostella, представника «нижчих багатоклітинних», є бластопоральний осьовий організатор, схожий зі шпеманівським організатором хребетних не тільки в загальних рисах, але і в багатьох деталях. Це — серйозний довід на користь гомології (загального походження) цих ембріональних структур. Мабуть, осьовий організатор, тісно пов’язаний з бластопором, був уже у спільного предка книдарій і білатерій. Виходить, що базовий механізм формування полярності та осей тіла, можливо, склався ще на зорі еволюції тваринного царства, а в подальшому піддавався різноманітним модифікаціям в різних еволюційних лініях.

Джерело: Yulia Kraus, Andy Aman, Ulrich Technau & Grigory Genikhovich. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer // Nature Communications. 2016. V. 7. Article number: 11694.

Див. також про організаторів і функції Wnt/^-catenin:

1) Розвиток хробаків починається з хвоста, «Елементи», 23.11.2006.

2) Розгадано механізм регенерації кінцівок, «Елементи», 27.11.2006.

3) Білок-регулятор індивідуального розвитку управляє рухом ракових клітин, «Елементи», 18.04.2008.

4) Генетичні механізми формування складних ознак поступово прояснюються, «Елементи», 14.04.2010.

5) Планарія — модельний об «єкт для вивчення регенерації у багатоклітинних», Елементи «, 16.05.2011.

6) Частини спинного мозку спочатку регулюються централізовано, а потім переходять на самоврядування, «Елементи», 01.10.2014.

7) Довгі плавники скатів — результат додавання нової точки росту, «Елементи», 22.12.2015.

Олександр Марков, Юлія Краус